微生物保藏及基本操作技术

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1、微生物保藏及基本操作技术中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC姚粟博士微生物菌种保藏菌种是进行微生物学研究和应用的基本材料，是发展生物工程的重要基础条件之一，是国家的重要生物资源。菌种保藏管理要求各保藏中心必须具有保藏菌种的详细历史及有关实验资料。并对其所负责保藏的菌种均应采取妥善、可靠的方法保藏，避免菌种的污染或死亡。《中国微生物菌种保藏管理条例》微生物菌种保藏制订专门菌种保藏管理制度；同一株菌种采用两种以上保藏方法保存；对只能采用一种保藏方法的菌株备份存放于两个以上的保藏设备中；对菌种的入库和出库记录入档，实行双人负责制管

2、理；设专人负责管理菌种保藏设施正常运行，定期检修维护。微生物菌种保藏微生物菌种保藏方法基本原理是在挑选优良纯培养物并使其处于休眠状态基础上，人为地创造一个有利于休眠的环境，使其长期保存后仍能保持菌种原有的优良特性。基本措施是低温、真空、干燥。常用菌种保藏方法定期移植法液体石蜡法真空冷冻干燥法-80℃低温冻结法液氮超低温冻结法定期移植法亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜的斜面培养基上，最适条件下培养，完成培养于4～6℃进行保存并间隔一定时间（3-6个月）进行移植培养的一种短期菌种保藏方法。操作步骤：斜面制备接种培养保藏接种定

3、期移植法操作简单，使用方便；对设备和人员要求不高；可随时使用，便于观察菌种；工作劳动强度大，属短期保藏，保藏成本高；菌种传代频繁，易退化、污染。液体石蜡法指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养好后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。操作步骤：液体石蜡预处理斜面培养物制备灌注石蜡保藏液体石蜡法操作简单，使用比较方便；对设备要求不高，对人员操作水平有一定要求；·菌种易退化、污染。真空冷冻干燥法指将保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经预冻后在真空条件下使水分

4、升华，再经真空封存后保存的一种长期菌种保存方法。安瓿管的准备清洗选用中性玻璃材质的安瓿管；2%盐酸浸泡8～10h，自来水冲洗至中性，蒸馏水冲洗2～3次；置于烘箱中烘干。棉塞打棉塞，160℃定型2h；标签激光打印标签，标明菌株编号和保藏日期，大小约10×20mm。喷码于安瓿管外，160℃固定20min。灭菌121℃，30min.保护剂的准备保护剂：12%脱脂牛奶蒸馏水溶液，2～5ml/管；灭菌锅加热至沸腾，将牛奶管放入锅中，113℃灭菌20min；打开放气阀缓慢排出蒸汽，取出灭菌后脱脂牛奶试管，迅速放入凉水中冷却；30℃培养2天

5、，无菌检查合格后备用。冻干样品制备制备斜面培养物；将保护剂用无菌吸管注入到斜面培养物上，用吸管刮取斜面上的菌体，使菌体均匀地悬浮在保护剂内。用长毛细滴管将菌悬液分装到安瓿管内，0.1～0.2ml/管，操作时要把带有菌悬液的长毛细滴管直接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。真空干燥在开动真空泵后应使真空度在15min内达到66.5Pa，随后逐渐达到26.6～13.3Pa，在此条件下，样品将保持冻结状态，其中水分则不断升华，干燥才能顺利地进行。终止干燥时间应根据下列情况判断：安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状真空度接近空载时的最高

6、值样品温度与管外温度接近选用1～2支对照管，其水份与菌悬液同量，当其水分完全蒸发时视为干燥完结预冻制备菌悬液、经分装到进行预冻之间的时间不宜超过1h；分装完成后将安瓿管立刻放入－35～－40℃冰箱预冻1h，使菌液完全冻结；可采用分段式预冻，先将分装好的安瓿管置－20℃冻30分钟，再放入－80℃冰箱冻30min；采用离心式冻干装置时勿需预冻。熔封将安瓿管的中上部用火焰烧软，拉成细颈；将安瓿管装到多歧管上，用火焰在细颈处熔封；拉管时注意火焰不要离菌体太近。真空度检测用高频电火花检查各安瓿管的真空情况，如管内呈现灰蓝光，说明真空度符

7、合要求。真空冷冻干燥法保藏、运输方便；保藏时间长(5～10年)；对设备要求高(真空冷冻干燥机、多歧管)，对人员操作水平要求高；冷冻干燥过程对菌体有损伤，需恢复培养。-80℃冰箱冻结法将菌种悬浮于保护剂中，在－80℃冰箱中冻结保存的一种长期菌种保藏方法。准备冷冻管准备保护剂（10%-15%甘油）准备菌悬液（细胞、孢子或芽孢悬液）制备冷冻管（取菌悬液和保护剂至冷冻管）保藏（-80℃，2～5年）-80℃冰箱冻结法使用方便；保藏时间较长；对设备要求高(-80℃冰箱)；运输不方便。液氮超低温冻结法指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置

8、于－196℃的液氮或－150℃左右的液氮气相中保存的一种长期菌种保藏方法。操作步骤冷冻管准备保护剂制备保藏培养物准备预冻—将程序降温系统预冷到4℃，将制备好的冷冻管放入其中，以1℃/min降温速率降至-35℃；—使用程序降温盒。保藏将预冻后的冷冻管转移至液氮气相(-150℃)