保藏法5---微生物菌种常规保藏技术规程.doc

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1、Ⅶ定期移植保藏法适用范围本方法适用于大多数细菌和真菌。原理低温条件下保藏可减缓微生物菌种的代谢活动，抑制其繁殖速度，达到减少菌株突变，延长菌种保藏时间的目的。保藏培养基一般含较多有机氮，糖分总量不超过2%，既能满足菌种培养时生长繁殖的需要，又可防止因产酸过多而影响菌株的保藏。技术要求不同菌种应根据要求选择合适的培养基。接种时要求无菌操作，避免染菌。保藏期间要定期检查菌种存放的房间、冷库、冰箱等的温度、湿度，各试管的棉塞有无污染现象，如发现异常应取出该管，重新移植培养后补上空缺。大量菌种同时移植时，各菌株的菌号、所用培养基

2、要进行核对，避免发生错误。每次移植培养后，应与原保藏菌株和菌株的登记卡片逐个对照，检查无误后再存放。斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外和污染造成损失。方法与步骤培养基制备器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，根据不同情况洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量。调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸或稀碱调pH值。加酸或碱液时

3、要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装，斜面培养基不宜超过试管高度的四分之一。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。灭菌根据要求将培养基灭菌。灭菌后摆放斜面时，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。无菌检查将灭菌的培养基

4、放入培养箱中作无菌检验。接种斜面接种A.4.2.1.1点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。7ⅦA.4.2.1.2中央划线从斜面中部自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。A.4.2.1.3稀波状蜿蜒划线法从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。A.4.2.1.4密波状蜿蜒划线法从斜面底部自下而上划密“之”字形线。能充分利用斜面获得大量菌体细胞，适用于细菌和酵母菌等。A.4.2.1.5挖块接种法挖取菌丝体连同少量琼脂培养基，转接到新鲜斜

5、面上。适用灵芝等担子菌类真菌。穿刺接种用直接种针从原菌种斜面上挑取少量菌苔，从柱状培养基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途径慢慢抽出接种针。适用于细菌和酵母菌等。液体接种挑取少量固体斜面菌种或用无菌滴管等吸取原菌液接种于新鲜液体培养基中。培养将接种后的培养基放入培养箱中，在适宜的条件下培养至细胞稳定期或得到成熟孢子。保藏保藏温度和时间培养好的菌种于4℃－6℃保存，根据要求每3－6个月移植一次。对于某些菌种，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，须1－3个月移植一次。保藏湿度用相对湿度表示，通常为

6、50%－70%。测量仪表采用毛发湿度计或干湿球湿度计。移植培养将培养物转接到另一新鲜培养基中，再在适宜条件下培养。菌种复壮菌种如有退化，应将退化的菌种引入原来的生活环境中令其生长繁殖，通过纯种分离，在宿主体内生长等方法进行复壮。液体石蜡保藏法适用范围本方法适用于不能分解液体石蜡的酵母菌、某些细菌(如芽孢杆菌属，醋酸杆菌属等)和某些丝状真菌(如青霉属，曲霉属等)。原理液体石蜡保藏法可作为定期移植保藏法的辅助方法。在液体石蜡覆盖下，菌种的生物代谢受到抑制，细胞老化被推迟。此方法可阻止氧气进入，使好气菌不能继续生长，也可防止因

7、培养基的水分蒸发而引起的菌体死亡，达到延长菌种保藏时间的目的。技术要求菌种培养参照附录A。应选用优质化学纯液体石蜡。液体石蜡易燃，在对液体石蜡保藏菌种进行操作时注意防止火灾。保藏场所应保持干燥，防止棉塞污染。保藏期间应定期检查，如培养基露出液面，应及时补充灭菌的液体石蜡。方法与步骤液体石蜡将液体石蜡分装加棉塞，用牛皮纸包好，0.1MPa灭菌30分钟取出，置40℃7Ⅶ恒温箱蒸发水分，经无菌检查后备用。斜面培养物的制备参照附录A，斜面宜短，不超过试管三分之一为宜。灌注石蜡无菌条件下将灭菌的液体石蜡注入刚培养好的斜面培养物上，

8、液面高出斜面顶部1厘米左右，使菌体与空气隔绝。保藏将注入石蜡油的菌种斜面直立存放于低温(4℃-15℃)干燥处，保藏时间为2-10年不等。恢复培养恢复培养时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次。沙土管保藏法适用范围本方法适用于产孢类放线菌、芽孢杆菌、曲霉属、青霉属以及少数酵母如隐球酵母和红