茯苓等9种中药植物雌激素活性筛选的实验研究

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1、茯苓等9种中药植物雌激素活性筛选的实验研究帕丽达·阿不力孜热娜·卡斯木盛萍丛媛媛，服部征雄【摘要】　　目的对几种中药进行了植物雌激素的活性筛选。方法采用人乳腺癌细胞增殖法与酵母菌雌激素筛检实验法对9种中药进行了植物雌激素活性的研究。结果成功地建立了E-SCREEN法与YeastEstrogenScreen实验法，此两种方法均可检测到1×10-13mol/L的雌二醇。在这两种体外雌激素活性筛选实验条件下，当归、泽泻、川芎、牡丹皮、桂枝均有雌激素活性；而茯苓、桃仁则无雌激素样活性。结论E-SCREEN法敏感性高，并有快速、简便等优点，适用于大量

2、化合物的初选。【关键词】人乳腺癌细胞增殖法酵母菌雌激素筛检实验雌激素活性　　Abstract：ObjectiveToevaluatetheestrogenicactivityofseveralkindsofChineseherbalmedicines.MethodsE-ScreenandYeastEstrogenScreentechnologyedicines.ResultsThetethodsdetectedestradiolatverylool/L.ItaeHikono.,AlismaorientaleJuzepczuk.,Cnidiu

3、mofficinaleMakino.,PaeoniasuffruticosaAndr.,CinnamomumcassiaBlume.hadestrogeniceffects,.It'ssuitableforlarge-scalescreeningforestrogenicityofenvironmentalchemicals.　　KeyaeHikono.(日本北海岛);川芎CnidiumofficinaleMakino.;桂皮CinnamomumcassiaBlume.;桃仁PrnuspersicaBatsch.;泽泻Alismaorien

4、taleJuzepczuk.;茯苓PoriacocosiexKitamura.;芍药PaeonialactifloraPallas.;牡丹皮PaeoniasuffruticosaAndr.（购于日本药局方）。各药材分别用10倍量水煮提两次，过滤，合并滤液并减压浓缩，真空干燥后配制成1mg/ml的水提液。　　1.2试剂EMDM培养基、无酚红EMDM培养基、17β-雌二醇、β-半乳糖苷酶、S.cerevisiac酵母菌株、SD培养基、Zymolase试剂（为Sigma公司产品），邻硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG，日本和汉药研究所提供），

5、胎牛血清（FBS，日本和汉药研究所提供），其余试剂均为日本产分析纯。　　1.3仪器电子读数分析天平(日本Shimaduz公司)；二氧化碳培养箱(日本SANYO公司)；倒置显微镜(日本Olympus)；台式高速低温离心机(美国BectonDickinson公司)；全温振荡培养基(美国BectonDickinson公司)；BIO-RADModel3550-UV紫外分光光度仪(日本SANYO公司)；25mm2培养瓶、96孔培养板（美国BectonDickinson）。　　2方法　　2.1细胞株及培养条件雌激素敏感的MCF-7人乳腺癌细胞由日本和汉

6、药研究所提供。以含5%胎牛血清（Hyclone）的DMEM培养基培养传代。培养条件：37℃，5%CO2，相对湿度95%。　　2.2人血清中甾体激素的去除成年人血清购于Sigma公司,按E-screen法去除其中的甾体激素〔4,5〕。　　2.3细胞增殖实验按E-screen法〔5〕并稍作修改，普通培养的MCF-7细胞经胰蛋白酶消化后以104个细胞/ml接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，贴壁24h后去除原培养基，换成实验用培养基：无酚红的DMEM基加10%热灭活的无雌激素人血清。继续培养5d，此时加入阳性（雌二醇）对照组设10-13～1

7、0-9mol/L5个浓度，不同浓度的受试物和阴性（溶剂）对照组，每个浓度设6个复孔。6d后弃上清液，每孔加5mg/ml的四唑盐（MTT）30μl，继续培养4h。吸去孔中的培养液，每孔加入150μl的DMSO，在540nm波长测定吸光度并计算增殖率，结果见表1。　　2.4酵母菌株和培养基的建立过夜培养的酵母转种至新的SD液体培养基中，加入不同浓度的植物提取物，于30℃恒温振荡器中培养4h，然后在595nm测定吸光度。　　2.5β-半乳糖苷酶活性的测定测定并记录培养液的OD595，离心，弃取上清液，加入Zymolase溶液，置37℃水浴中培养1

8、5min，再加入ONPG溶液，置30℃水浴中培养30min，加入1MNa2CO3100μl终止反应。在450，540nm波长测定吸光度，并计算β-半乳糖苷酶活性（U）值。结果见表