单纯疱疹病毒2型gg2“独特区”基因的原核表达及其血清学诊断价值

《单纯疱疹病毒2型gg2“独特区”基因的原核表达及其血清学诊断价值》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、单纯疱疹病毒2型gG2“独特区”基因的原核表达及其血清学诊断价值作者：孙乐栋，曾抗，王茜，周再高，刘凤岩【摘要】目的在大肠杆菌中表达HSV2的gG2“独特区”基因(gG2T)并对其免疫学特性进行初步研究。方法克隆HSV2的gG2T，并在大肠杆菌中表达gG2T融合蛋白。通过ethodsT载体连接，4℃放置12h。将重组载体转化为DH5α感受态细胞，于氨苄青霉素抗性固体LB培养基上37℃培养16h，利用XGal和IPTG筛选阳性重组克隆。　　1.6HVS2gG2T基因表达载体的构建将鉴定阳性的克隆扩大培养，提取质粒并用EcoR

2、Ⅰ/XhoⅠ双酶切重组质粒，获取gG2T片段，与同样经过EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切的表达载体pGEX4T1连接，转化DH5α感受态细胞。对阳性克隆扩大培养并提取质粒，转化BL21感受态细胞。提取转化菌质粒进行EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定，将转化菌送TaKaRa公司测序。　　1.7gG2T基因在BL21中的表达与纯化重组表达质粒pGEX4T1gG2T转化BL21后，优化表达条件，将阳性克隆在37℃条件下含氨苄青霉素的LB培养基中培养至A600值为0.5-0.6时，加入异丙基βD硫代半乳糖苷(isopropylthioβD

3、galactosid,IPTG)至终浓度0.2mmol/L，28℃条件下诱导2h。用聚丙稀酰胺凝胶电泳和ol/LpH9.5碳酸盐缓冲液(包被液)稀释纯化蛋白至终质量浓度0.2g/L，微空板每孔加入200μL，4℃过夜。弃去包被液，每孔加入封闭液(100g/LBSA)200μL，37℃封闭1h，用PBST洗涤5次，拍干。每孔加入1∶100稀释的待测血清100μL，37℃孵育2h，用PBST洗涤5次，拍干。每孔加入1∶1000稀释羊抗人IgG抗体100μL，37℃孵育2hPBST洗涤5次，拍干。加邻苯二胺(Ophenydiamino,OPD)和H

4、2O2显色10min，加入50μL终止液终止反应，立刻于490nm条件下测A值。　　2结果　　2.1HVS2gG2T基因的扩增所获目的片段大小为591bp。测序结果表明插入片段序列与GenBank中HSV2333株对应部分核酸同源性为99.8%。　　2.2重组表达载体的鉴定提取阳性转化质粒进行PCR及EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定，0.07g/L琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR可扩增出591bp的片段，双酶切结果显示4900bp和591bp的片段(图1)。　　图1PCR鉴定及双酶切重组质粒载体pGEX4T1gG2T（略）　　Fig.1

5、IdentificationofrebinantpGEX4T1gG2Tbydoubledigestion　　M:DNAmarkerDL15000;1:pGEX4T1gG2TplasmiddigestedbyEcoRⅠ/XhoⅠ;2:identificationofrebinantpGEX4T1gG2TbyPCR　　2.3目的片段在E.coliBL21中的表达用100g/LSDSPAGE电泳检测表达产物，对HVS2gG2T/BL21诱导前和诱导后进行比较，发现HVS2gG2T/BL21诱导后在46ku左右有一条

6、明显的新生蛋白条带，与预计大小的融合蛋白的大小相符，凝胶扫描分析显示融合蛋白占菌体蛋白的60%左右。通过超声裂解后，融合蛋白可溶性表达在上清中含量占上清蛋白的40%左右。:theloolecularprotEinmarker;1:thelysateofpGEX4T1gG2T;2:thelysateofpGEX4T1gG2TinducedIPTG;3::theloolecularproteinmarker;1:thepurifiedtargetproteinpGEX4T1gG2Ta等[6]利用杆状病毒表达系统表达gG2(2

7、81aa-594aa)，检测HSV2型感染患者血清特异性抗体，特异性和敏感性达到95.5%。由此说明这两段区域的肽段适合用作临床抗体检测，尤其适合用作HSV2分型诊断。　　研究发现HSV2的gG2基因序列抗原区域极少突变，即使出现了点突变也不会消弱gG2的血清学活性[7]。该报告进一步证实gG2基因可以作为型特异性抗原，同时指出gG2基因的保守性是作为HSV2特异疫苗成分的先决条件。　　本实验成功构建出HSV2型gG2“独特区”(285aa482aa)基因片段，利用原核表达载体表达出含有gG2“独特区”的融合蛋白，通过ic

8、robiol,2003,41(8):36813686.　　[5]GraboesonC,LaingP,etal.Identificati