瘢痕成纤维细胞的钙网蛋白表达研究

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1、瘢痕成纤维细胞的钙网蛋白表达研究目的　观察钙网蛋白(CRT)在瘢痕及正常皮肤成纤维细胞内的表达情况。方法　采用免疫细胞化学染色和原位ELISA技术对体外培养的瘢痕及正常皮肤成纤维细胞进行CRT分布定位及表达水平研究。结果　瘢痕和正常皮肤成纤维细胞在处于增殖生长状态时，胞浆及核内均有不同程度的CRT表达，其中瘢痕成纤维细胞表达CRT水平(A:1.97±0.15,ELISA492nm)明显高于正常皮肤成纤维细胞水平(A:1.43±0.12),差异有非常显著意义(P＜0.01)；而在已融合的瘢痕和正常皮肤成纤维细胞内则均无CRT表达。结论　瘢痕成纤维细胞内CRT的丰富表达对促进细胞迁移、信号

2、传递及钙存储等方面均有着积极作用。　　Studyontheexpressionofcalreticulininhypertrophicscar-derivedfibroblasts　　　【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheexpressionlevelandintracellulardistributionofcalreticulin(CRT)inhypertrophicscar-derivedfibroblasts(HSF)andnormalskin-derivedfibroblasts(NSF).MethodsUsinganti-CRTantibo

3、dy,CRTmunocytochemistryandELISAtechnique.ResultsCRTandnuclEiinproliferatingHSForNSFinculture,butHSFpossessedsignificantlyhigherexpressionlevelofCRTthanNSF(P＜0.01).EM添加10%小牛血清(上海华美生物技术有限公司)。96孔塑料培养板及100mm培养皿(丹麦Nunc公司)。　　1.3　成纤维细胞培养　　手术切取增生性瘢痕及正常皮肤组织，去皮下脂肪，0.01%新洁尔灭浸洗10min，PBS洗3次，用组织剪将组织剪成细小碎块并接种于

4、培养皿内，加少量10%小牛血清的DMEM培养基，37℃5%CO2静止培养，3天后补充少量培养剂，隔2天换液，见有细胞从组织块爬出生长后每天换液，传代。　　1.4　CRT免疫细胞化学染色　　体外培养的成纤维细胞去培养基后，PBS轻洗，2%多聚甲醛固定10min，0.3%双氧水反应5min，PBS再洗；二抗血清37℃20min，抗CRT抗体37℃作用45min，HRP-兔抗羊IgG37℃反应1h，DAB显色；显微镜下观察显色信号。　　1.5　CRT原位ELISA检测［7］　　选择第5代培养细胞为实验对象，用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞，调整细胞浓度至106/ml，每孔100μl接种于9

5、6孔培养板内。培养16h后，去培养剂，PBS清洗；2%多聚甲醛固定10min，0.3%双氧水反应5min，PBS洗；与0.1%TritonX-1004℃作用3min后，进一步分别与5%小牛血清(37℃、20min)、抗CRT抗体(37℃、1h)、5%小牛血清PBS稀释的HRP-兔抗羊IgG(37℃、1h)反应；PBS清洗后加入OPD底物液100μl，作用30min后用50μl1mol/L硫酸中止反应。ELISAreader上读取492nm的P值。　　2　结果　　2.1　成纤维细胞初代培养结果　　在体外相同培养条件下，细小的瘢痕及正常皮肤组织块接种后2天见有部分贴壁，培养1周后有少量的成

6、纤维细胞从组织块边缘爬出，2周后细胞在组织块周围呈晕状分布，此后细胞开始向外旺盛扩散增殖。显微镜下观察瘢痕及正常皮肤组织来源的成纤维细胞形态，发现细胞均呈细小梭形状，二者未见明显差异。　　2.2　成纤维细胞CRT表达的免疫细胞化学染色结果　　原代培养的瘢痕及正常皮肤成纤维细胞在未生长融合前，细胞内均有不同程度的CRT阳性表达；一旦细胞生长融合后，在融合区内的成纤维细胞中均未见有明显的CRT阳性信号出现，但在融合区边缘仍处于增殖、迁移扩散的瘢痕及正常皮肤成纤维细胞内，则仍有CRT的阳性信号分布；就二种细胞内CRT的表达信号强弱来看，瘢痕成纤维细胞内的CRT阳性信号相对较强，而正常皮肤成纤

7、维细胞内CRT阳性信号相对较弱；另外，当瘢痕及正常皮肤成纤维细胞以较高密度传代培养时，细胞内CRT表达在接种后16h较为明显，而在培养24h细胞接近融合时信号较弱。　　此外，CRT在瘢痕及正常皮肤成纤维细胞内的表达区域无明显差异，往往在细胞浆、核膜及核内均有表达。　　2.3　成纤维细胞CRT表达的ELISA检测结果　　根据CRT免疫细胞化学染色结果，我们对第5代瘢痕及正常皮肤成纤维细胞(接种后培养16h)进行CRT表达的ELISA检测，其中正常