2006年秋冬季青岛地区婴幼儿病毒性腹泻病原分析论文

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1、2006年秋冬季青岛地区婴幼儿病毒性腹泻病原分析论文【摘要】目的了解青岛地区引起婴幼儿病毒性腹泻的主要病原组成及其流行情况。方法2006年9~12月，采集青岛市儿童医院婴幼儿病毒性腹泻大便样品共38份，采用胶体金法检测轮状病毒；采用RT-PCR法检测星状病毒和人杯状病毒。结果在38份样品中检测到轮状病毒7份，阳性率为18.42%；检测到星状病毒4份，阳性率为10.53%；检测到人杯状病毒6份，阳性率为15.79%。其中1份混合感染星状病毒和人杯状病毒，1份混合感染轮状病毒和星状病毒，未发现轮状病毒和人杯状

2、病毒的混合感染。结论2006年秋冬季.freelainpathogensandtheepidemicofviraldiarrheaininfantsinQingdao.MethodsThirty-eightstoolsamplesdiarrheapatientsattendingQingdaochildren’shospitalduringSep.toDec.of2006.Rotavirusethod.AstrovirusandCalicivirusongthe38specimens,sevenpleha

3、dmixedinfectionofAstrovirusandCalicivirus;one’shadmixedinfectionainvirusesinvolvedinviraldiarrheaduringautumnandin离心10min，取上清200μL进行核酸提取，提取试剂盒采用美国Roche公司生产的HighPureViralRNAKit，按试剂盒使用说明书提取病毒RNA。1.2.3轮状病毒检测方法采用胶体金法进行检测，试剂盒由北京万泰生物药业有限公司生产，批号为20050030，操作按试剂盒说

4、明书进行。1.2.4星状病毒检测方法RT-PCR采用日本TaKaRa公司的OnestepRNAPCRkit(AMV)，反应体系为10×Buffer5μL，25mmol/LMgCl210μL，10mmol/LdNTPs5μL，4×107U/LRnaseInhibitor1μL，5×106U/LAMV-OptimizedTaq1μL，5×106U/LAMVReverseTranscriptaseXL1μL，Mon269和1μL，Mon270各1μL，引物反应浓度为0.2g/L,模板1μL，补加水到50μL。R

5、T-PCR条件为42℃30min，94℃2min，94℃30s,56℃30s,72℃1min，35个循环后72℃延伸10min。取扩增产物6μL点样于20g/L琼脂糖凝胶上，电泳20min，用凝胶成像仪观察电泳结果，观察是否有预期分子质量的条带出现。1.2.5人杯状病毒检测方法病毒RNA提取方法同上。RT-PCR检测采用日本TaKaRa公司的OnestepRNAPCRkit(AMV)，反转录反应体系为10×Buffer2.5μL，25mmol/LMgCl24μL，10mmol/LdNTPs5μL，0.2g

6、/L289引物1μL，5×106U/LAMVReverseTranscriptaseXL0.35μL，4×107U/LRnaseInhibitor0.1μL，RNA模板1.5μL，补加水到25μL，反应条件为42℃1h。PCR反应体系为10×Buffer5μL，25mmol/LMgCl24μL，10mmol/LdNTPs1μL，0.2g/L289引物1μL，0.1g/L290引物1μL，5×106U/LAMV-OptimizedTaq酶0.4μL，cDNA8μL，补加水到50μL；反应条件为94℃3min

7、；94℃60s,58℃80s,.freelin，共30个循环；然后72℃延伸10min。电泳实验同星状病毒检测方法。2结果2.1轮状病毒检测在38份粪便标本中，检测到阳性样本7份，阳性率为18.42%。2.2星状病毒检测在38份粪便标本中，检测到阳性样本4份，阳性率为10.53%（图1）。2.3人杯状病毒检测在38份粪便标本中，检测到阳性样本6份，阳性率为15.79%（图2）。本次实验用289、290简并引物针对RNA多聚酶编码区进行RT-PCR，诺如属病毒扩增片段大小为319bp,扎如属病毒扩增片段大小

8、为331bp；由于两者片段相差不大，本实验结果不能将其进行区分，PCR产物经序列测定，带入GenBank中应用Blast功能进行序列在线比对分析，测序结果显示6份PCR产物序列均为诺如病毒RNA聚合酶序列。2.4混合感染情况在38份粪便标本中，1份混合感染星状病毒和轮状病毒，1份混合感染星状病毒和人杯状病毒，未发现轮状病毒和人杯状病毒的混合感染。图1粪便样品星状病毒的PCR检测①~④分别为样品9、31、37、39;M为DNAM