辛伐他汀对脂多糖诱导的细胞黏液高分泌的抑制

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1、辛伐他汀对脂多糖诱导的细胞黏液高分泌的抑制作者：杨捷冯玉麟耿艳鸣乔云飞【摘要】目的观察具有抗炎活性的辛伐他汀对脂多糖(LPS)诱导的肺泡上皮细胞A549黏蛋白表达的影响并探讨其机制。方法用不同浓度的辛伐他汀作用于培养的A549细胞，采用定量RTPCR、ELISA和明胶酶谱法分别检测细胞的黏蛋白MUC5ACmRNA表达水平、MUC5AC蛋白含量及细胞上清基质金属蛋白酶(MMP)9活性。结果辛伐他汀组细胞中MUC5AC蛋白含量及MUC5ACmRNA水平较脂多糖组均明显下降(P<0.05)，且浓度越高，作用越强。在正常

2、情况下A549细胞培养上清液中几乎检测不到MMP9活性，而LPS作用后上清中MMP9活性明显增强(P<0.01)，预先给予不同浓度辛伐他汀孵育细胞培养上清液MMP9活性显著下降(P<0.05)。结论LPS诱导的A549细胞黏蛋白MUC5AC在mRNA和蛋白水平的升高与MMP9活性增强有关,而辛伐他汀可减少LPS诱导的MUC5ACmRNA及蛋白表达，且呈浓度依赖性,提示其作用可能与抑制MMP9活性有关。【关键词】辛伐他汀;脂多糖;黏蛋白;肺泡上皮细胞黏液高分泌是包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘等在

3、内的慢性气道炎症性疾病重要病理生理特征。过度分泌的黏液因其可加重气流阻塞并作为细菌定植和生长的培养基，导致抗生素效能下降，而成为影响疾病死亡率的一项独立危险因素〔1〕。细菌感染可促进黏液高分泌，即临床所说的痰液增多，甚至痰栓形成，其中革兰阴性杆菌的重要毒力因子脂多糖(LPS)是强效促黏液分泌剂。在本研究中，体外黏液高分泌模型的建立是通过LPS刺激具有表达黏蛋白能力的肺泡上皮细胞A549。气道黏液的黏弹性主要取决于由黏膜下腺体的黏液腺细胞和气道上皮的杯状细胞合成的高度糖苷化蛋白质的黏蛋白(MUC)。现已证实MUC5AC是慢性

4、炎症时呼吸道黏液所呈现的主要MUC表型〔2〕。研究表明，他汀类降脂药具有抗炎作用，并对病毒性肝炎、肾炎等疾病具有治疗作用。本研究通过LPS诱导A549细胞建立体外黏液分泌模型，旨在初步探索辛伐他汀对气道黏液分泌的影响及机制。　　1材料与方法　　1.1材料肺泡上皮细胞株A549由本实验室保存。辛伐他汀购自杭州默沙东制药公司;LPS、明胶、噻唑蓝(MTT)、Tripure购自美国Sigma公司;胰蛋白、RPMI1640购自美国Gibco公司;胎牛血清购自杭州四季青公司;小鼠MUC5AC单克隆抗体购自Chemicon公司;基质

5、金属蛋白酶明胶酶谱法电泳分析试剂盒为上海GeneMedScientifics公司产品;TaqDNA聚合酶为美国Promega公司产品;PCR试剂盒为大连宝生物工程公司产品;cDNA第一条链合成试剂盒购自上海生物工程技术服务有限公司。　　1.2细胞培养A549细胞常规培养于含10%灭活的胎牛血清，并加入1%L谷氨酰胺及1%青霉素和链霉素的RPMI1640培养液中，放置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中孵育;当细胞融合达70%～90%时，换用无血清培养基继续培养24h。　　1.3药物处理〔3〕辛伐他汀按16mg/ml溶

6、于0.06mol/LNaOH和40%乙醇，于50℃加热2h，用HCl调整溶液pH至7.2，加入等体积的蒸馏水，使其浓度为40μmol/L，冻存于-20℃备用。采用MTT比色法检测实验浓度辛伐他汀对细胞活力影响，酶联免疫检测仪于570nm波长测定各孔吸光度值(A)。计算细胞活力：细胞存活率=实验组A值/阴性对照组A值×100%，每实验组设8个复孔，取均值。　　1.4分组细胞随机分为对照组(无血清培养基培养)、LPS组(无血清培养基中加入10μg/mlLPS)、辛伐他汀组(无血清培养基中加入30μmol/L辛伐他汀)、LPS+

7、20μmol/L辛伐他汀组(先于无血清培养基中加入20μmol/L辛伐他汀孵育30min后，再给予同样浓度LPS)、LPS+30μmol/L辛伐他汀组(先于无血清培养基中加入30μmol/L辛伐他汀孵育30min后，再给予同浓度LPS)，各组均培养24h后行指标检测。　　1.5荧光定量RTPCR检测细胞MUC5ACmRNA表达提取细胞总RNA，并逆转录为cDNA，再行定量PCR。引物由上海Genebase生物公司合成。MUC5AC上游引物序列为5′TCCTTCTTGTCAATGGTGTCT3′;下游为5′ACCAGGTT

8、CAGGACAAGTAG3′;GAPDH上游引物序列为5′CCTCAAGATTGTCAGCAAT3′;下游为5′CCATCCACAGTCTTCTGAGT3′。根据目的基因MUC5AC与管家基因GAPDH的标准曲线，将提取的RNA样品进行定量，PCR反应条件是预变性：94℃×2min;再94℃25s，50