生物技术与应用实验

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1、生物技术原理与应用实验（供生物工程和生物技术专业使用）夏焕章编写沈阳药科大学生物技术与生物制药教研室2002年6月·36·目录实验一细菌感受态的制备和质粒的转化……………………实验二碱变性法提取质粒DNA………………………………实验三水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA…………………实验四DNA的限制性内切酶酶切……………………………实验五DNA的回收与连接……………………………………实验六基因的PCR扩增（聚合酶链式反应）……………实验七用温度敏感型启动子表达系统表达目的基因…实验八基因组合生物合成新化合物………………………（1）（

2、5）（10）（14）（18）（23）（29）（36）·36·实验一细菌感受态的制备和质粒的转化实验目的通过实验学会感受态细胞的制备方法和DNA转化的最基本操作，以及如何提高转化效率的思路。本实验综合因素较多，难度较大，是分子生物学中的一个很关键的实验手段。实验原理转化是指某一细胞系由于接受了外源DNA，而导致其原来的遗传性状发生改变，这种遗传性状包括遗传型和表型的改变。感受态是受体菌能接受外源DNA能力的一种生理状态。用CaCl2处理细菌，改变细胞膜的结构，使质粒DNA能够穿过细菌细胞膜进入细胞。然后在选择性培养基中培养转化处理过

3、的细菌，转化成功的细菌可以在选择性培养基上生长形成菌落。本实验采用质粒pUC118转化大肠杆菌DH-5a，通过氨苄青霉素抗性筛选转化子。·36·图1-1　　质粒pUC118/pUC119图谱实验材料和试剂（一）实验材料大肠杆菌DH-5a质粒pUC118（ampicillin，AmpR）（二）培养基和试剂1.LB液体培养基(%)胰蛋白胨（Tryptone）0.5酵母浸出粉（Yeastextract）1.0NaCl0.5pH7.2～7.4（用2mol/LNaOH调节）（分装：20ml/250ml三角瓶，每组2瓶。3ml/试管，每组2管

4、。0.07Mpa高压灭菌30分钟）。2.LB固体培养基LB液体培养基加入1.6%的琼脂粉即可。（分装：50ml/250ml三角瓶，加入0.8克琼脂粉，每组1瓶。0.07Mpa高压灭菌30分钟）。3.抗生素：氨苄青霉素（ampicillin,，Amp），配制成100mg/ml备用。4.0.1mol/LCaCl2溶液(配制方法：称取1.1克无水CaCl2，溶于90ml蒸馏水中，定容至100ml，装于250ml三角瓶中，0.07Mpa高压灭菌30分钟，4℃保存。）（三）器材·36·接种针10ml移液管50ml塑料离心管5ml移液管90m

5、m培养皿1ml移液管1.5mlEppendorf管200ml吸头三角爬15×150试管冰块试管铝帽牛皮纸纱布盖线绳硫酸纸（四）仪器净化工作台摇床机恒温水浴锅离心机培养箱实验步骤以下均需无菌操作（一）感受态细胞的制备1.大肠杆菌DH-5a冷冻保存的菌种，挑取一环，划线接种在LB固体培养基平板上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）。2.从长好的平板上挑取一个单菌落，转接在含有3mlLB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜（约16小时）。3.取0.3ml菌液接种于20mlLB液体培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养2～3小时

6、，待OD600值达到0.3～0.4时，取下三角瓶，立即置冰浴10～15分钟。4.将细菌转移到一个灭菌的50ml离心管中，4℃3000r/min离心10分钟，弃去上清液（尽可能将所有的上清液去净），收集菌体。5.加入20ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2·36·溶液，重新悬浮菌体，使菌体分散均匀，置冰浴中30分钟。6.4℃3000r/min离心10分钟，弃去上清液（尽可能将所有的上清液去净）。7.再加入2ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2溶液，小心重新悬浮菌体（操作要轻）。在4℃冰箱中放置12～24小时，即可应用于DNA

7、转化。（二）细菌的转化1.取大肠杆菌DH-5a新鲜感受态细胞100ml于1.5mlEppendorf管中，加入50～100ng质粒pUC118DNA，轻轻旋转以混合内容物，在冰浴中放置30分钟。2.42℃热休克120秒，不要摇动Eppendorf管。3.加入LB液体培养基900ml，37℃保温60分钟。4.取100ml转化液涂布在含氨苄青霉素（Amp）100mg/ml的LB固体平板上，37℃倒置培养16～24小时。5．观察平板，长出的菌落可能就是转化子，可进一步提取质粒鉴定。【提示】实验操作中注意的问题1.DNA与感受态细胞混合后，

8、一定要在冰浴条件下操作，如果温度时高时低，转化效率极差。2.Eppendorf管盖紧，以免反应液溢出或外面水进入而污染。3.42℃热处理时很关键，转移速度要快，但温度要准确。4.涂布转化液时，要避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁