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时间:2018-11-24
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1、优化图书馆室内空间布局[摘要]目的:在外源抗原表位表达载体系统中构建并表达乙型肝炎病毒(HBV)抗原表位,并对其诊断敏感性进行评价。方法:人工合成编码HBV“a”抗原决定簇表位中24个氨基酸(S124147)的寡核苷酸序列,克隆入外源抗原表位表达载体系统FHVRNA2I3位点,构建重组质粒,在原核pET系统(BL21细胞)中表达。通过ELISA和FPSCCCTKPTDGNC147)寡核苷酸序列:正向5’GATGCACGACTCCTGCTCAAGGCAACTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATTGC3’;反向3’CTACGT
2、GCTGAGGACGAGTTCCGTTGAGATACAAAGGGAGTACAACGACATGTTTTGGATGCCTACCTTTAACG5’,两端为Bsu36I识别位点,与经Bsu36I作用后的重组pETFHVDNA混匀后置室温连接2h,转化DH5α细胞,接种LB平板(200μg/mlAmp)培养。重组质粒pETEDNA经酶切筛选并经DNA序列测定。 1.2.2携带HBV抗原表位的嵌和蛋白的表达重组pET系统中,嵌和蛋白的表达受T7启动子的控制[2]。BL21经重组pETEDNA转化后,在TB培养液中37℃生长16h~18h,细胞经4000r/10min离心沉淀,用超声裂
3、解缓冲液悬浮,超声裂解,裂解液经离心,弃上清,沉淀(包涵体)用8mol/L尿素溶解。 1.2.3SDSPAGE及RESCO公司产品;第二抗体辣根过氧化物酶(HRP)结合物购自华美公司。 1.3HBV重组抗原表位诊断意义评价 1.3.1ELISA检测血清样本固相ELISA检测如前文所述[1],以纯化的嵌和蛋白为包被抗原,每孔100μl(含1μg纯化嵌和蛋白),检测58份乙肝患者血清中抗HBs,与抗HBsELISA检测试剂检测结果比较。阳性判断标准为(检测血清A492底物对照A值)/(阴性血清A492底物对照A值)>2.1。邻苯二胺二氢盐酸(OPD)购自AMR
4、ESCO公司;第二抗体辣根过氧化物酶(HRP)结合物购自华美公司;乙肝患者血清由昆明市传染病医院收集;抗HBsELISA检测试剂盒购自上海科华公司。 1.3.2HBV重组抗原表位Westernblot检测血清样本方法见前文[3],检测了58份乙肝患者血清样本。 2结果 2.1携带HBV抗原表位的嵌和蛋白的表达FHVRNA2cDNA载体系统即重组pETFHV构建见文献[4],其编码产物是FHV外壳蛋白,三维立体结构已得到精确测定,其上有6个可供外源抗原表位插入的位点[5](见图1)。应用该系统,我们将人工合成HBV抗原表位寡核苷酸序列插入到重组pETFHVDNA上
5、,构建携带HBV抗原表位的重组质粒pETE,经NsiⅠ和NcoⅠ双酶切筛选(见图2)和DNA序列测定无误后转化BL21细胞,高水平表达嵌和蛋白。经SDSPAGE和考马斯亮蓝染色(见图3)和Westernblot(见图4)分析结果表明,这些嵌和蛋白为携带有HBV抗原表位的重组FHV外壳蛋白。 图1FHV外壳蛋白的三维结构:示可供选择的外源抗原表位序列插入位点L1、L2、L3、I1、I2,I3HBV抗原表位氨基酸序列在FHV中插入位点。(略) 图2重组质粒NcoⅠ+NsiⅠ酶切图(略) 2.2携带HBV重组抗原表位的嵌和蛋白在BL21中的表达与鉴定携带HBV抗原表位的重
6、组质粒pETFHVE在BL21(DE3)转化细胞中高水平表达了携带HBV抗原表位的嵌合蛋白FHVE,其分子质量与阳性对照相同,约为45000(等于载体FHV外壳蛋白的分子质量43000加上HBV抗原表位的分子质量)。经SDSPAGE和考马斯亮蓝染色(见图3)及agniusLO,etal.AneinantofhepatitisBsurfaceantigen[J].ActaPatholMicrobiolScan,1975,83B:295297. [7]oynihanJS,DmelloFI,etal.48mersyntheticpptideanalogueofthehep
7、atitisBvirus"a"determinantinducesanantiHBsantibodiesresponseafterasingleinjection[J].JMedVirol,2000,62:159166. [9]TismizekySG.FEBSLetters,1994,353:14. [10]陈元鼎.刘名英,邹永健,等.表达轮状病毒SA11株Vp4的抗原表位诱导病毒中和抗体生成[J].中国病毒学,1997,12:125131. [11]PengM.D
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