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《原发性肝癌外周血白蛋白基因片段扩增的临床意义》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、原发性肝癌外周血白蛋白基因片段扩增的临床意义 原发性肝癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）是临床最常见、治疗最难的恶性肿瘤,HCC切除和肝移植是治疗的最佳选择,但绝大多数患者在术后发生移植肝或远处复发,其原因是在术前未能检出微转移灶或术中肝癌细胞释放入血所致,因而如能早期准确地检出外周血或淋巴结转移灶,才能设法降低复发率提高生存率[1，2]。本研究以RT-巢式PCR方法分析肝病患者外周血中Alb-mRNA,以观察它们在肝癌诊断、肝癌远处转移判断的临床价值。 1材料与方法 1.1
2、研究对象门诊和住院患者中收集急性肝炎12例、慢性肝炎20例、肝硬化16例、肝癌67例（男61例，女6例，年龄25~81岁，平均49.8±11.4岁）和非肝肿瘤14例（肺癌和胃癌各5例，食管癌、胰腺癌、结肠癌和胆管癌各1例）。肝癌和肝炎的诊断分别按照全国肝癌防治协作组标准和1995年北京全国肝炎会议制定标准核实诊断。另从健康正常人中收集外周血标本20份作为对照。所有标本于清晨空腹采血5ml，以肝素抗凝并及时存于4℃保存，作外周血有核细胞制备。所有研究对象均以放射免疫分析法检测血AFP浓度。
3、1.2外周血有核细胞分离及总RNA制备肝素抗凝血在2小时内以淋巴细胞分离液及密度梯度离心法分离外周血有核细胞。经生理盐水洗涤两次后进行有核细胞计数。置于无RNAase的匀浆器中,加入TRIzol1.0ml匀浆2分钟,提取总RNA,最后加入TE缓冲液100μl，取部分RNA于UV-2201型紫外分光光度计上测A260，换算出总RNA浓度。经紫外分光扫描鉴定,已纯化的RNA未受到污染或降解，其余RNA置于-85℃保存备用。 1.3巢式PCR引物设计参照文献报道的人类白蛋白核苷酸序列,自行设计巢式PCR
4、扩增引物，由中国科学院上海细胞研究所合成。设计扩增序列位于人类白蛋白基因的1385-1806号核苷酸序列之间。Alb外部引物：Alb-15'-AGAAAGTACCCCAAGTGTCAA-3'(nt，1385-1405),Alb-25'-AGCTGCGAAATCATCCATAAC-3'(nt,1786-1806);内部引物：Alb-35'-GTGTCAACTCCAACTCTTGTA-3'(nt,1398-1419），Alb-45'-TCAAGATTTGTCTCTCCTTCT-3'(nt，1699-1720)
5、。 1.4逆转录巢式PCR扩增方法肝细胞中总RNA先经随机引物(Promega)和逆转录酶(Gibco/BRL)合成Alb-cDNA，逆转录反应程序为：23℃，10分钟；42℃，60分钟；95℃，10分钟。逆转录结束后在PE480型DNA扩增仪上行巢式PCR扩增,PCR循环程序为:93℃，30秒；55℃，30秒；72℃，1分钟连续35个循环结束后,在72℃10分钟后于4℃保存。第一阶段PCR以外部引物(Alb-1,Alb-2)和cDNA为模板,扩增产物为422bp；第二阶段PCR，以已扩增第一次PCR产
6、物为模板和内部引物（Alb-3,Alb-4）进行扩增,最终PCR产物323bp。 1.5统计学方法计量资料以x±s表示进行F检验，两两比较用q检验，计数资料用χ2检验，以P<0.05表示组间差异具有统计学意义。 2结果 2.1外周血Alb基因扩增法灵敏度以RT-巢式PCR法，对67例HCC外周血标本中有核细胞进行分离，分别应用了RT-PCR(一阶段)和RT-巢式PCR(二阶段)对其mRNA进行扩增分析。结果如图RT-PCR检出Alb基因的阳性率分别为5.9%(4/67)；R
7、T-巢式PCR对两者的检出阳性率分别为59.7%(40/67)，可见2种方法的扩增阳性率间存在非常明显的差异（P<0.05)。外周血中Alb基因的扩增区带，主要见于肝癌患者和急性肝炎患者。区带清晰未见非特异性扩增区带出现（见图2）。按肝癌组织中总RNA浓度为5μg/μl标本,分别稀释102、103、104、105、106、107和108倍，以RT-巢式PCR进行扩增分析，可见在总RNA浓度为5pg/μl以上时均可出现阳性。 2.2肝病患者外周血中Alb基因的扩增分析分别对肝病、肝
8、外肿瘤和正常对照标本的外周血有核细胞中的Alb-mRNA进行了扩增分析(表1)。Alb基因片段的检出率在肝癌组为59.7%，明显高于除急性肝炎组外的其他各组。 2.3Alb基因检出率与肝癌临床分期在所分析肝癌患者中,对肝癌的临床分期、是否伴有肝内或肝外转移进行分组比较，其结果见表2。Alb基因片段阳性率，在Ⅰ期和Ⅱ期两肝癌组中未见明显差异,但在临床Ⅲ期肝癌患者中，Alb基因的检出率为76.9%(30/39)，显著高于Ⅰ期和Ⅱ
