肿瘤坏死因子基因多态性与多发性骨髓瘤的 临床相关关系

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1、肿瘤坏死因子基因多态性与多发性骨髓瘤的临床相关关系【摘要】目的探讨肿瘤坏死因子α（Tumornecrosisfactoralpha,TNFα）基因–308位和淋巴毒素（Lymphotoxinα,LTα）基因+252位基因多态性与多发性骨髓瘤（MultipleMyeloma，MM）发病、临床及预后的相关关系。方法用聚合酶链反应（PCR）、限制性内切酶消化及电泳技术，对32名MM患者和72名正常对照者的TNFα和LTα基因的单碱基突变多态性进行检测，并收集病人组的临床资料，进行生存状况分析。结果(1)MM病人TNF两位点基因型频率、等位基因频率、联合单倍体分型中各型的频率与对照组比较差

2、异均无统计学意义（P>0.05）；(2)比较MM病人两位点联合单倍体分型在不同性别、分期、肿瘤负荷、血红蛋白、血钙、血肌酐中的分布，没有发现显著性差异（P>0.05）；(3)用KaplanMEier方法进行生存分析，没有发现高危型与低危型的总生存时间有显著性差异：在高危型组和低危型组，2年生存率和4年生存率差异无统计学意义（P>0.05）；Cox回归模型显示两位点联合单倍体分型不是影响预后的危险因素（P>0.05）。结论本组研究显示TNFα–308位、LTα+252位基因多态性在MM病人发病的易感性、临床和预后中可能不起重要作用。【关键词】多发性骨髓瘤肿瘤坏

3、死因子基因多态性0引言多发性骨髓瘤（multiplemyeloma,MM）是来源于淋巴细胞系统的异常浆细胞过度增生的恶性肿瘤。有研究发现肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactoralpha,TNF)可诱导MM细胞形成自分泌IL6环路；在骨髓，TNF与其它细胞因子形成一个细胞因子调控网络，调节MM细胞的生长。故一般认为，TNF可能与MM的发生或发展相关。淋巴毒素（LTα，又称为TNFβ）与TNFα同属一细胞因子家族，二者生物学效应类似。TNFα和LTα的基因多态性有可能通过影响这两种细胞因子的表达，进而影响MM的发生与发展。为探讨TNFα和LTα基因多态性与中国人MM发

4、病、临床和预后的相关性，我们对32名MM患者的TNFα和LTα基因的单碱基突变多态性进行检测，了解上述基因位点在广东地区MM病人中的分布情况，并对其进行临床观察与随访研究。1材料与方法1.1研究对象（1）MM组：32例，为2001年4月到2002年6月期间在中山大学第一附属医院、广东省人民医院住院确诊的MM患者,年龄44～72岁，中位年龄59岁；（2）对照组：72例，选自同期献血员和中山大学第一附属医院教职工，其中男性43名、女性29名，中位年龄24岁。上述所有观察对象均为广东汉族,彼此间无亲缘关系。1.2TNFα、LTα基因目的片段多态性的检测1.2.1DNA提取两组均取外周静脉血

5、1ml,EDTA抗凝，NaI法抽提基因组DNA。-80℃保存。1.2.2TNFα基因多态性片段的扩增扩增含TNFα–308位多态性位点片段的正反引物是5′AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT3′和5′TCCTCCCTGCTCCGATTCCG3′。PCR扩增体系50μl，含10×Buffer5μl（含1.5mmol/LMgCl2），2mmol/LdNTP2.5μＬ，20mmol/L的正反引物各1μl，TaqDNA聚合酶（购自加拿大真达公司）2.5U，基因组DNA100～150ng。先热启动，94℃预变性2min，再以下列温度和时间循环35次：94℃60s，60℃60s

6、，72℃60s，最后再72℃延伸4min。循环中热盖温度103℃。扩增片段长度为107bp。1.2.3LTα基因多态性片段的扩增扩增含LTα+252位多态性位点片段的正反引物分别是5′CTCCTGCACCTGCTGCCTGGATC3′和5′GAAGAGACGTTCAGGTGGTGTCAT3′。PCR扩增体系（50μl），除20mmol/l的正反引物各0.6μl外，其余与TNFα的扩增体系相同。先95℃预变性10min，再95℃60s，64℃60s，72℃120s，如此循环31次，循环中热盖温度103℃。扩增片段长度为368bp。1.2.4NcoⅠ限制性内切酶消化扩增片段取PC

7、R扩增产物10μl，加入限制性内切酶NcoⅠ（购自宝生物公司）8U，依说明书加入BSA、10×KBuffer两种缓冲液各2μl,37℃孵育5h，孵育结束后加2μl10×LodingBuffer终止反应。两基因酶切方法和过程相同。1.2.5凝胶电泳TNFα消化产物以8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒压450V，电泳2.5h，0.012mol/l硝酸银染色后在凝胶上呈现深棕色条带，干胶保存。LTα消化产物以2.5%琼脂糖凝胶电泳，100V40min,溴化乙锭（EB）染