凝血酶诱导非小细胞肺癌血管内皮生长因子分泌的实验

《凝血酶诱导非小细胞肺癌血管内皮生长因子分泌的实验》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、凝血酶诱导非小细胞肺癌血管内皮生长因子分泌的实验作者：王盛兰王熙才伍治平金从国陈晓群蒋永新谷玉兰陈艳周永春腾毅山【摘要】目的探讨凝血酶对非小细胞肺癌细胞株A549分泌血管内皮生长因子（Vascularendothelialgrol的浓度范围内可以明显地增加VEGF的分泌，而＜0.5U/ml时这种促进作用则不明显，水蛭素能够完全阻断凝血酶的这种促进作用。PAR1在A549细胞中表达，而在正常的胎肺细胞（KMB17）中并不表达。结论在一定浓度范围内，凝血酶能有效地促进A549细胞VEGF的分泌，而这种促进作用可能与PAR1受体的表达有关。【关键词】凝血酶

2、；水蛭素；非小细胞肺癌；血管内皮生长因子1材料与方法1.1主要材料Trizol试剂，购自天为时代生物有限公司；RTPCR试剂盒、PCR试剂盒，由MBI公司生产；凝血酶冻干粉、重组水蛭素冻干粉，由SIGMA公司生产；人VEGFELISA试剂盒，购自深圳晶美生物有限公司；RPMI1640培养基，购自GIBCO公司；新生小牛血清，购自中国医学科学生物工程研究所。1.2方法1.2.1细胞培养A549细胞于RPMI1640培养基+10%小牛血清,对数生长期收集细胞,调整细胞浓度为2×105/ml,KMB17细胞于DMEM培养基+10%小牛血清培养。1.2.2EL

3、ISA方法检测VEGF的分泌（1）标本收集肺非小细胞肺癌患者血清138份（包括腺癌57例、鳞癌68例、大细胞癌13例），保存于-20℃冰箱。（2）细胞培养上清液的收集①将A549细胞稀释到上述浓度，接种于24孔板，培养6h后细胞贴壁生长，更换细胞培养液同步24h。实验分组（每组8孔）：凝血酶0.5U/ml组、凝血酶1.0U/ml组、凝血酶3.0U/ml组、以1640培养液为空白对照，收集细胞培养上清液保存于-20℃。②将A549细胞稀释到上述浓度，接种于24孔板，培养6h后细胞贴壁生长，更换培养液。实验分组（每组8孔）：凝血酶3.0U/ml细胞、凝血酶3.

4、0U/ml细胞+3.0U/ml水蛭素、以1640培养液为空白对照，分别在6、16、24h收集细胞培养上清液保存于-20℃。(3)VEGF的测定按照人VEGFELISA试剂盒说明进行测定,在实验中标准品和样本均双复孔检测。1.3逆转录聚合酶链式反应1.3.1细胞A549、KMB17总mRNA的提取(1)直接在贴壁生长细胞的培养瓶中加入Trizol（1ml/10cm2），用尖吸管反复吹打几次后，将裂解液移入EP管中，加入1/5Trizol体积的氯仿，充分震荡，4℃12000g×5min；(2)吸上层水相移入新管，加1/2体积的异丙醇，4℃12000g×10m

5、in去上清，沉淀用75%乙醇洗涤，-20℃放置20min,4℃12000g×15min；(3)去上清，室温干燥，4℃12000g×5min，沉淀溶于20μlDEPCddH2O中；(4)紫外分光光度仪测量OD值，分析浓度和纯度。1.3.2RTPCR按检验试剂盒说明书分RT及PCR两步进行：①分别加入5μg总RNA、cDNA合成引物酶抑制剂、dNTP、MMLV逆转录酶、DEPCddH2O，至终体积20μl，42℃×60min,70℃×10min。②加入PCR反应体系、上下游引物、超净水进行反应。循环条件：热启动94℃、30s；57℃、30s；72℃、1m

6、in，31个循环；延伸72℃、7min。扩增PAR1cDNA。PAR1引物：上游引物5’CCACAAACGTCCTCCTGATT3’和下游引物5’TGGGATCGGAACTTTCTTTG3’，扩增片段大小为200bp。同时扩增βaction作为内参照物。引物序列为：5’ACACTGTGCCCATC3’和5’AGGGGCCGGACTCGT3’，PCR扩增产物长度为300bp。1.3.3电泳及成像经1.0%琼脂糖凝胶(1%溴化乙锭染色)电泳(75MV，40min)鉴定，凝胶成像分析系统观察、照相。1.4统计学处理数据采用统计学软件包SPS

7、S12.0处理，（取均数±标准差）进行t检验、方差分析和LDS检验，P＜0.05为差异有统计学意义，趋势图采用EXCEL制作。2结果2.1凝血系统激活对肺癌患者的血管内皮因子分泌的影响实验发现，纤维蛋白原激活患者的血管内皮生长因子分泌较纤维蛋白原浓度在正常范围内2~4g/L的患者明显升高,凝血状态的激活与否与血管内皮生长因子的分泌有关（P<0.05），见表1。表1患者纤维蛋白原(Fgb)状态与VEGF浓度的关系例数(人)Fgb(g/L)VEGF浓度(pg/ml)71＞4645.66±57.29*672~4499.91±51.21*：与纤维蛋白原浓度在

8、正常范围内组别比较，P＜0.05，差异有统计学意义2.2凝血酶对A