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《轮状病毒新型vp6基因的拼接合成和序列测定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、轮状病毒新型VP6基因的拼接合成和序列测定作者：张彩红,张强哲,张彦明【关键词】轮状病毒；,VP6基因；基因,合成；,基因工程疫苗【Abstract】AIM:Todesignandobtainnovelrotavirus(RV)VP6gene.METHODS:Onthebasisofourpreviousreports,RVVP6geneizedthroughthegradualsplicingmethod,accordingtotheimprovedPCRstrategy.RESULTS:TheoptimizedcDNAse
2、quenceofRVVP6geneizedRVVP6geneentofnoveloralrotavirusgeicengineeringvaccine.【KeyAb对RV感染具有免疫保护作用,肌注免疫VP6DNA疫苗可产生较好的异源保护作用［6］,以VP6蛋白和黏膜佐剂免疫小鼠可诱导产生对鼠RVEDIM株的完全保护作用［7］.根据我国RV的感染状况,本课题组的疫苗设计方案主要包括A组RV的VP6抗原和A组RVG1，G2和G3型3种不同的VP7抗原.前期免疫效果研究结果表明,灌胃免疫组产生的RV特异性免疫反应较滴鼻组弱,推测可能
3、与疫苗在胃肠道受到胃酸和消化酶的降解破坏作用,导致其表达量降低和免疫效果弱化有关.据此，为了发展新型高效的口服RV基因工程疫苗,我们应用改良的嵌套式PCR策略,通过逐步拼接法对RVVP6基因进行了优化合成研究,以期提高其(G+C)含量,可望增加其表达量和提高以其为目标抗原的RV疫苗的免疫效果.1材料和方法1.1材料PcDNAⅡ质粒,E.coliDH5α菌种和E.coliDH10B菌种均为本室保存.AgaroseGelDNApurificationKit,PyrobestDNApolymerase,T4DNALigase,限制性
4、DNA内切酶KpnⅠ，XhoⅠ，EcoRⅠ，EcoRV,XGal,IPTG,DNAMarkerDL2000,dNTPmixture和Amp均为Takara产品；RNA酶为Sigma产品；酵母提取物和胰蛋白胨为OXOID产品；PEG(4000)为Promega产品.1.2方法1.2.1引物合成引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.1.2.2RVVP6基因的优化合成根据RVVP6基因的氨基酸序列和人类细胞偏爱的密码子,重新设计了RVVP6基因的重组cDNA序列,合成了引物P11～P116和P21～P216与sP115和sP2
5、16.根据嵌套式PCR方法制备突变体的原理［8］,我们应用改良的嵌套式PCR策略,通过逐步拼接法人工合成RVVP6基因的重组cDNA序列.2结果2.1RVVP6基因S1和S2片段的合成应用改良的嵌套式PCR策略,通过逐步拼接法人工合成RVVP6基因的重组cDNA序列，RVVP6基因全长S片段分为S1和S2片段两部分先分别合成,再以S1和S2片段为模板，合成RVVP6基因全长S片段，合成策略见图1，2.获得RVVP6基因S1和S2片段（图3，4），对其进行酶切和测序鉴定（图5，6），合成片段序列正确.2.2获得优化的RVVP6基
6、因全长S片段逐步拼接法获得了约1220bp的RVVP6基因全长目的片段（图7）,进行酶切（图8）和测序鉴定,目的片段序列正确.1:RVVP6基因全长S片段；2:DNA标准DL2000.图7RVVP6基因全长S片段的PCR产物1:DNA标准DL2000；2:RVVP6基因全长S片段阳性重组质粒.图8RVVP6基因全长S片段阳性重组质粒酶切鉴定2.3RVVP6基因优化改造前后的序列对比分析应用改良的嵌套式PCR策略,通过逐步拼接法成功地优化合成了RVVP6基因.与优化改造前的野生型序列相比,优化后的RVVP6基因(G+C)含量提高
7、了约20％.优化改造前后的序列对比和(G+C)含量分析见表1.表1RVVP6基因优化改造前后的序列对比分析3讨论国内外新型病毒疫苗发展规划将RV预防性疫苗列为新型病毒疫苗研制的重点项目之一,全球疫苗与免疫接种联盟（GAVI）和］.北京：科学出版社,2001:558-562.［4］LynchM,ShiehonicaM,McNeal,JohnL,etal.CD4+Tcellsaretheonlylymphocytesneededtoprotectmiceagainstrotavirussheddingafterintranasal
8、immunizationericVP6protEinandtheadjuvantLT(R192G)［J］.JVirol,2002,2:560-568.［8］［美］CM.迪芬巴赫,GS.德维克斯勒主编.黄培堂,余炜源，陈添弥，等译.PCR技术实验指南［M］.北京：科学出版社,1
