DNA体外合成与序列测定

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1、DNA的体外合成DNA的化学合成DNA的化学合成广泛用于合成寡核苷酸探针和引物，有时也用于人工合成基因和反义寡核苷酸。目前寡核苷酸均是用DNA合成仪合成的，大多数DNA合成仪是以固相磷酰亚胺法为基础设计制造的。2021/7/141南京农业大学生命科学学院石河子大学生命科学学院1.合成的原理核酸固相合成的基本原理是将所要合成的核酸链的末端核苷酸先固定在一种不溶性高分子固相载体上，然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序逐一接长。每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作，由于接长的核酸链始终被固定在固相载体上，所以过量的未反应物或反应副产物可通过过滤或洗涤的方法除去。

2、合成至所需长度后的核酸链可从固相载体上切割下来并脱去各种保护基，再经纯化即可得到最终产物。石河子大学生命科学学院DNA的化学合成合成的原理核酸固相磷酰亚胺法合成时，末端核苷酸的3′-OH与固相载体成共价键，5′-OH被4，4′-二甲氧基三苯甲基(DMTr)保护，下一个核苷酸的5′-OH亦被DMTr保护，3′-OH上的磷酸基上有-N(C3H7)2和-OCH3两个基团。2021/7/143石河子大学生命科学学院2021/7/14南京农业大学生命科学学院4每延伸一个核苷酸需四步化学反应：(1)脱三苯甲基：末端核苷酸的DMTr用三氯乙酸/二氯甲烷溶液脱去，游离出5′-

3、OH。(2)缩合：新生成的5′-OH在四唑催化下与下一个核苷3′-磷酰亚胺单体缩合使链增长。(3)盖帽：有少量(小于0.5%)未缩合的5′-OH要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。(4)氧化：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷。上述步骤循环一次，核苷酸链向5′方向延伸一个核苷酸。石河子大学生命科学学院DNA的化学合成2.合成后处理合成后的寡核苷酸链仍结合在固相载体上，且各种活泼基团也被保护基封闭着，要经过以下合成后处理才能最后应用。切割：合成的寡核苷酸链仍共价结合于固相载体上，用浓氨水可将其切割下来。切

4、割后的寡核苷酸具有游离的3′-OH。脱保护：切割后的寡核苷酸磷酸基及碱基上仍有一些保护基，这些保护基也必须完全脱去。磷酸基的保护基β-氰乙基在切割的同时即可脱掉，而碱基上的保护基苯甲酰基和异丁酰基则要在浓氨水中55℃放置15h左右方能脱掉。纯化：纯化的目的主要是去掉短的寡核苷酸片段，盐及各种保护基等杂质。通常采用的纯化方法有电泳法、高效液相色谱法和高效薄层色谱法等。纯化这一步操作是可以选择的，对要求不高的应用如PCR等可不纯化。近年来发展了一些修饰试剂，可在合成寡核苷酸时，对某些核苷酸进行一定的修饰，为寡核苷酸探针的非放射性标记提供了新途径。2021/7/14

5、5石河子大学生命科学学院第二节DNA的体外合成聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应是上世纪80年代发展起来的一种体外快速扩增特异DNA序列的技术。此技术于1985年由Mullis发明，1988年耐热TaqDNA聚合酶的发现令该技术使用更加方便、有效。PCR可以说是20世纪核酸分子生物学研究领域的最重大发明之一，这不仅表现在该方法本身的简单和巧妙，而且还表现在它的出现高速发展了大量在以前看来似乎不可能的生物学技术。Mullis因其卓越的贡献而获1993年的诺贝尔化学奖。2021/7/146南京农业大学生命科学学院石河子大学生命科学学院聚合酶链式反应（PCR）P

6、CR的原理：原理类似于DNA的天然复制过程。即在模板DNA、寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）底物和Mg2+存在的条件下，由耐热的TaqDNA聚合酶催化DNA的复制，合成靶DNA。PCR包括三个基本过程：变性。加热模板使其解离成单链。退火。降低温度使人工合成的寡核苷酸引物与模板DNA中所要扩增的靶序列的两侧按碱基配对原则相结合。延伸。在适宜条件下，TaqDNA聚合酶利用dNTP使引物3′端向前延伸，合成与模板碱基完全互补的DNA链。这样变性、退火和延伸构成一个循环，每一次循环的产物可作为下一次循环的模板，经过30～35个循环后，界于两个引物之间的靶序

7、列得到大量复制，拷贝数约增加106～107倍。2021/7/147石河子大学生命科学学院2021/7/14南京农业大学生命科学学院8石河子大学生命科学学院核酸序列测定DNA测序是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是核苷酸排列方式。RNA测序则通常将RNA提取后，反转录为DNA后使用DNA测序的方法进行测序。在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前应用最广泛的是：Sanger双脱氧链终止法。Maxam-GilbertDNA化学降解法。新技术：杂交测序法，质谱法，单分子测序法，原子探针显微镜测序法，DNA芯片法。2021/7/1

8、4南京农业大学生命科学学院9石河子大学