基于质谱的dna序列测定进展

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1、基于质谱的DNA序列测定进展许崇峰　杨芃原　岳贵花　卞利萍　　摘　要　对质谱DNA序列测定的各种技术的原理、进展、面临的困难以及发展的前景作了评述。　　关键词　质谱　DNA序列测定　评述　　Abstract　ThisarticlegivesareviewonDNAsequencingbymassspectrometry,includingtheprinciplesofMStechniques,andtheirprogress,difficultiesandperspective.　　Keywords　Massspectrometry;DNAseq

2、uencing;Review1　引言　　DNA序列分析在生物基因学以及遗传病和病毒性疾病的诊断和治疗上具有重要的作用。用质谱化学方法进行DNA序列分析是一种新兴的技术。Sanger双脱氧链终止序列测定方法［1］是常规的DNA序列分析方法，Sanger产物需要通过凝胶分离和显色来得到DNA的序列信息。而当采用质谱(MS)时，Sanger产物可不需分离而直接测定，因而质谱方法具有快速性的优点。80年代中后期相继出现的质谱离子化新技术电喷雾(ESI)和基体辅助激光解析电离(MALDI)使得用质谱进行DNA序列测定成为可能。但是由于技术尚不成熟，目前使用

3、质谱方法仅能测定含几十个碱基的寡聚核苷酸。要使质谱在人类基因工程(HGP)和临床分析中得到广泛的应用，质谱技术和质谱方法必须得到显著改善。2　生物质谱方法　　生物质谱，有别于传统质谱，测定的对象是分子量可高达几万至几十万的生物分子，这使得传统的电子轰击(EI)、化学电离(CI)等电离技术的应用受到了极大的限制。随着快原子轰击(FAB)、MALDI、ESI、离喷雾(IS)、大气压下碰撞电离(APCI)等电离技术的出现，大大提高了质谱的测定范围。特别是ESI-MS和MALDI-MS显示了在生物大分子分析(如蛋白质和核酸)上的巨大潜力。2.1　ESI-

4、MS　　电喷雾是一种软电离方法。通常认为电喷雾可以用两种机制来解释：1)离子蒸发机制，在喷针针头与施加电压的电极之间形成了强电场，该电场使液体带电，带电的溶液在电场的作用下向带相反电荷的电极运动，并形成带电的液珠(液滴)。由于小雾滴的分散，比表面增大，在电场中迅速蒸发，结果使带电雾滴表面单位面积的场强高达108V/cm2，从而产生液滴的“爆裂”。重复此过程，最终产生分子离子；2)带电残基(分子)机制，首先也是电场使溶液形成带电雾滴，带电雾滴在电场作用下运动并迅速溶去，溶液中分子所带电荷在去溶时被保留在分子上，结果形成离子化的分子。一般来讲，电喷雾

5、方法适合使溶液中的分子带电而离子化。离子蒸发机制是主要的电喷雾过程，但对质量数大的分子化合物，带电残基的机制也会起相当重要的作用。　　电喷雾所形成的离子是多电荷离子，由于质谱测定的是质荷比，这就拓宽了它所能测定的质量范围，使得它适合于生物大分子的测定。2.2　MALDI-MS　　MALDI也是一种软电离方法，它利用激光束照射分散于基体(又称基质、底物)中的样品，由于样品被包裹在基体中，因而大部分激光能量被基体所吸收，从而保护了样品分子。MALDI中的基体起到了多种重要的作用：从脉冲激光中吸收足够的能量；隔离样品分子；提供光激发的酸或碱基团，以及在

6、离子-分子碰撞中电离样品分子。目前MALDI比较公认的机理是：激光光束的能量首先被发色团的基本吸收，接着这些基体迅速蒸发为气相，被包含的分析物的分子从而被带入气相。而离子化的产生是由于受激的基体分子将质子转移给分析物分子。　　MALDI可以由不同类型的质谱来实现，特别是飞行时间质谱(TOF)。理论上，飞行时间质谱的质量上限是无限的，这决定了它特别适合于生物大分子分子量的测定。3　MALDI-MS和ESI-MS在寡聚核苷酸测序上的进展3.1　寡聚核苷酸的MALDI测定　　Spengler［2］等人首先利用MALDI测定了几种含四至六个碱基的寡聚核苷

7、酸。他们发现，用MALDI分析寡聚核苷酸远比分析多肽和蛋白质困难。在过去的几年中，随着新的基体材料的发展，样品制备方法的改进和对离子化过程机理的更深入理解，MALDI所能测定的寡聚核苷酸的质量范围得到稳步提高。　　早期的重要发现是用铵离子交换碱金属离子会显著地减少离子加合物的形成；接着的进展是引入新的基体。几乎所有分析物的MALDI信号对基体化合物是高度敏感的。因此，寻找合适的基体对于解决寡聚核苷酸的分析是至关重要的。最成功的基体化合物之一是3-羟基砒啶甲酸(3-HPA)。　　现在能用MALDI质谱检测到的最大的DNA物种是一个有500个碱基的双

8、链DNA分子［3］。但是测定的质量分辨率仅为20～30。而要分辨Sanger产物，必须将质量分辨率提高一个数量级，达到300以上。　　在