胰腺组织总蛋白分步提取法的建立论文

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1、胰腺组织总蛋白分步提取法的建立论文【摘要】目的：通过对提取狗胰腺组织总蛋白不同方法的研究，建立提取胰腺组织总蛋白的标准方法.方法：用常规的总蛋白一步提取法和三步提取法，以三种溶解性能不同的裂解液分步提取胰腺组织中的总蛋白，测量蛋白浓度并分别用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrixassistedlaserdesorptionionizationtimeofflightmassspectra,MALDITOFMS)做蛋白全谱.结果：一步法和分步法总蛋白提取量分别为(18.8±1.2)mg和(23.3±0.9)mg，MALDITOFMS蛋白全谱的谱峰数分别为(

2、22.2±4.5)个和(32.8±3.8)个.结论：分步法与常规的一步法相比具有蛋白提取率高、蛋白溶解性好等优点.【关键词】总蛋白蛋白质组基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱提取0引言近年来,胰腺癌的发病率有逐年增多的趋势.手术切除率虽然有所提高,但5年生存率低于5%［1］.提高生存率的关键是早期诊断，但现有的肿瘤标志物敏感性和特异性均不理想.蛋白质组学（proteomics）的出现为寻找一种敏感性和特异性较高的肿瘤标志物带来了希望［2］.由于蛋白质组研究相关技术体系建立时间较短,目前仍存在许多有待改进之处,特别是在蛋白质样品制备方面.目前常用的组织总蛋白提取方法对于提取胰腺组织总

3、蛋白存在一定缺陷，组织总蛋白质一步提取法在完全溶解组织总蛋白(特别是疏水蛋白质)以及蛋白的分离效果等方面存在缺陷.这些不足之处直接影响了蛋白质组分析结果的全面性和准确性.我们尝试采用三步提取法［3］分步提取胰腺组织总蛋白,并和常规的一步提取法相对比，旨在建立提取胰腺组织总蛋白的标准方法.1材料和方法1.1材料健康杂种雄性犬1只.freela公司.蛋白酶抑制剂(cocktail)，胰酶抑制剂，3［(3胆酰胺丙基二乙胺］丙磺酸(3［(3Cholamidopropyl)dimethylammonio］1propanesulfonate,CHAPS)，三氟乙酸(TF

4、A)均购自Solarbio公司.Trisbase,二硫苏糖醇(DTT,北京鼎国公司)；Bradford蛋白浓度测定试剂盒（Beyotime公司）.VCX130PB超声破碎仪(美国Sonics公司)，低温超速离心机（美国Beckman公司），Ultrospec1100Pro紫外分光光度计(瑞典Amersham公司)，MALDITOFMS质谱仪（ABI公司）.1.2方法1.2.1标本采集取狗的新鲜胰腺组织，1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗以去除血液和其他组织.取同一部位的一块组织留作实验用，其余组织立即放入液氮中速冻后转存于-70℃冰箱.1.2.2总蛋白的一步提取取0．3g胰腺

5、组织标本用预冷的1×PBS液冲洗去除血液和其他组织，在冰面上用眼科剪剪成0.5mm×0.5mm×0.5mm小块并加入配置好的3mL裂解液：7mol／L尿素，2mol／L硫脲，5mL/LIPGbuffer(pH3～10)，65mmol／LDTT，40g/LCHAPS，5mg/L蛋白酶抑制剂，10mL/L胰酶抑制剂，混匀，在冰面上用超声粉碎.4℃离心，120000g,30min，上清为蛋白提取物标记为A，冻存于-70℃冰箱中.1.2.3总蛋白的分步提取第一步，取0.3g胰腺组织用预冷的1×PBS液冲洗去除血液和其他组织，在冰面上用眼科剪剪成0.5mm×0.5mm×0.5mm小块并加

6、入1mL裂解液I：40mmol／LTrisbase(pH8.1～8.3)，5mg/L蛋白酶抑制剂，10mL/L胰酶抑制剂，混匀，在冰面上用超声粉碎.4℃离心，120000g,30min，取上清标记为B1，冻存于-70℃冰箱中.第二步，在第一步沉淀离心管中加入1mL裂解液Ⅱ：8mol／L尿素，40mmol／LTris.5mL/LIPGbuffer(pH3～10)，65mmol／LDTT.40g/LCHAPS，5mg/L蛋白酶抑制剂，10mL/L胰酶抑制剂.混匀，超声粉碎、离心条件同前，取上清标记为B2,冻存于-70℃冰箱中.第三步，用1mL裂解液Ⅲ：7mmol／L尿素，2mmo

7、l/L硫脲，20g/LSB310，20g/LCHAPS，5mL/LIPGbuffer，5mg/L蛋白酶抑制剂，10mL/L胰酶抑制剂，溶解第二步沉淀物.再行超声粉碎，离心条件同前.取上清标记为B3，冻存于-70℃冰箱中.1.2.4蛋白含量测定按照Bradford蛋白浓度测定试剂盒的操作步骤操作.一步法和分步法所得到的总蛋白提取物分别测定总蛋白浓度，根据各自浓度计算出相应的总蛋白含量.分步法中将计算出的各步提取的蛋白含量相加即为其最终提取出的总蛋白量.1.2.5质谱分析将样品按1∶100稀释