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1、牙本质涎磷蛋白G0代转基因小鼠的获得作者：孙汉堂，肖明振，吴补领，徐国江，费俭【关键词】牙本质涎磷蛋白GenerationoftransgenicmousefoundersofDSPP 【Abstract】AIM:ToestablishtetracyclineresponsiveregulatedtransgenicmiceofdentinsialophosphoprotEin(DSPP).METHODS:DSPPcodingsequenceidpBluescriptDSPPandthetransgenicvectoredige
2、stionandsequencing,thefinalplasmidedpTRE2DSPP.AfterlinearizedbyXhoIandrecovery,theplasmidicroinjectedintothemalepronucleusofthezygotesandthezygotesingoodconditionplantedintopseudopregnantmice.ThetailDNAof3bryosplantedto28recipientpseudopregnantmice,entofthetransgenicl
3、ineprogressedfromthe6positiveones.CONCLUSION:ThefoundersofthetetracyclineresponsiveregulatedtransgenicmiceofDSPPareestablishedsuccessfully. 【Keyice,transgenic;microinjections 【摘要】目的：构建四环素调控性牙本质涎磷蛋白（DSPP）转基因体系中的受控小鼠系.方法：从质粒pBluescriptDSPP中，将小鼠DSPP编码序列亚克隆到pTRE2的NotI/S
4、alI位点间，构建转基因载体，经酶切鉴定和测序确认后，命名为pTRE2DSPP；将XhoI酶切线性化的载体DNA纯化后，显微注射到小鼠受精卵的雄原核中，挑选生长状态好的受精卵，移植到假孕母鼠的输卵管.仔鼠出生3erPE9700型PCR仪，BioRadSmartSpec3000紫外分光光度计，GIS凝胶图像处理系统.4，加500μL裂解液，50μL蛋白酶K，56℃消化过夜.离心，无水乙醇沉淀，700mL/L乙醇洗涤，干燥后溶解于200μL纯水中，紫外分光光度计定量. 转基因阳性鼠.反应条件：95℃预变性5min；94℃变性1mi
5、n，60℃退火1min，72℃延伸3min，35个循环；72℃延伸10min. Southern杂交：选PCR阳性者，各取DNA30μL（约15μg），用EcoRI消化，电泳，变性，中和，转膜，紫外交联，即可行杂交，探针为以显微注射用DNA为模板、以P1、P2为引物所获得的DSPPcDNA片段. G0代整合小鼠每只一笼饲养，后与C57小鼠配种，雌性1∶1，雄性1∶2.F1代整合小鼠每系取雄性：雌性1∶1~3合笼，F2代即可行纯合子鉴定.建系同时对小鼠进行大体观察. 2结果 由于pBluescript空载体与含DSPP编
6、码序列的片段大小相当，我们先用PvuI将载体切断，然后用NotI/SalI将含DSPP编码序列的片段切出，故电泳呈现3条带（Fig1A）；克隆中，NotI/SalI切出3.0kb及3.8kb者为阳性（Fig1B）； PCR鉴定阴性者应当得到约1.8kb的片段，阳性者应当得到约1.0kb的片段，85只小鼠中，符合此条件的为10只，号码为3,7,12,21,25,26,59,63,66,75.Fig2显示的是部分鉴定结果. Fig3显示的是SouthernBlot鉴定结果.按照设计，转基因阳性者应出现约3.0kb的条带.号码为3,
7、7,21,25,26,59的共6只小鼠确认为阳性.一个整合阳性的G0代小鼠与C57小鼠交配产生后代，称为一个单系.通过目前对转基因小鼠的大体观察，尚未发现明显表型异常. 3讨论 牙本质涎磷蛋白（DSPP）可裂解为牙本质涎蛋白（DSP）和牙本质磷蛋白（DPP），是牙齿特异性蛋白. DSPP不仅仅表达于牙齿［3,4］.而且在成釉细胞［5］、牙胚周围胚胎性网织骨和新生的软骨中［4］也有表达.我们试图通过转基因的方法，建立一种DSPP功能研究的动物模型，选用了显微注射法制备转基因小鼠，是目前应用较为广泛的一种方法，其基本原理是用
8、精细的显微注射针将外源基因直接注入动物受精卵的雄原核，使外源基因整合到基因组，从而获得转基因动物.其优点是基因导入确实可靠，转移率较高，可导入的目的基因较长，DNA用量省，试验周期短. 我们分别建立了两种小鼠系，即调控者（载体用pTeton质粒构
