分子生物学方法检测结核杆菌对利福平耐药性研究进展

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1、分子生物学方法检测结核杆菌对利福平耐药性研究进展　　摘要:近年对结核杆菌耐药机制的研究表明，rpoB基因是利福平耐药相关基因，耐药株通常发生特定位点基因突变，因此可以通过鉴定突变有无而评估其利福平耐药性，本文对这方面研究做一简要综述。　　结核病至今仍是世界上一个严重的公共卫生问题，估计目前全世界每年有800万新病例发生，290万人死于结核病，是当今单一致病菌致死的最主要死因。近十几年来结核病疫情呈现全球性明显回升趋势，产生原因之一是耐药菌株的产生和播散。1990年我国结核病流行调查结果表明，我国临床分离株耐药率达39.9％，初始耐药率31.7％，复治继发耐药率47.8％。利

2、福平是一种主要的抗结核药物，对利福平耐药常常导致化疗失败，且被认为是多耐药菌株的标志之一。因此早期迅速对结核患者利福平耐药性进行鉴定十分重要。现将有关研究进展做进一简要综述。　　传统方法依靠直接或间接含药培养进行结核分支杆菌利福平耐药性鉴定，这是体外结核杆菌耐药性的直接证据，并且可以了解其对利福平耐药程度。但各实验室间所用培养基不同，检测方法不同，结果判定标准不一，导致结果报告差异，并且由于结核分支杆菌本身属于缓慢生长菌，使得耐药培养耗时长，通常需8～12周，不能满足现代短程化疗需要。　　近年发展起来的应用BACTEC460TB系统进行结核杆菌快速培养及药敏测定可以大大缩短

3、结果回报时间，但此法建立在培养方法基础上仍需数天出结果，加之仪器试剂昂贵，有放射性污染等，限制了临床广泛应用。　　1利福平耐药基因的研究　　关于结核杆菌利福平耐药机制一直存在三种假设，膜通透性改变、耐药质粒介导及染色体组基因突变（耐药性有关基因），其中已证实耐药基因突变与利福平耐药有密切关系。　　对于细菌利福平耐药基因研究首先在大肠杆菌取得重要突破。首先发现利福平耐药的大肠杆菌其RNA聚合酶有突变并且只发生在β亚单位上，并推知产生这种β亚单位突变的基因位点相接，进一步对基因研究获得了大肠杆菌野生株编码RNA聚合酶β亚单位基因（rpoB）序列，并发现耐利福平的大肠杆菌有rpo

4、B基因突变。由于编码RNA聚合酶基因在细菌进化中呈高度序列保守性，根据对大肠杆菌利福平耐药基因的研究资料，Telenti[1]首先对结核分支杆菌利福平耐药基因突变进行了全面研究，发现在与大肠杆菌rpoB基因突变高发区（Ⅰ区）相应位点（511～533aa）的长69bp片段内，64/66耐药株有突变发生，而未见于56株利福平敏感结核菌株。此后许多研究都证实这一结果，并发现发生于此区城内新的突变位点[2～5]。而Miller[6]做了这样一项研究，他应用致点突变技术造成编码rpoB基因531号氨基酸（参考大肠杆菌基因位点）碱基突变并将其导入利福平敏感的耻垢分支杆菌株LRZZZ中，

5、使之发生了表型改变，即由原来的利福平敏感株转为利福平耐药，也证实rpoB基因突变是导致利福平耐药的唯一原因。s[4]对一患者感染的结核杆菌株发生利福平耐药表型转换前后做了rpoB基因序列分析研究，证实表型发生改变后其耐药基因发生了改变。但ropB基因突变致利福平耐药详细机制目前还未十分明了。　　2分子生物学检测方法　　上述对结核杆菌利福平耐药机制研究取得的重要成果为运用分子生物学方法进行耐药性评估提供了坚实的理论依据，其技术路线基本上是在用PCR方法对rpoB基因突变集中区域扩增基础上，对扩增产物进行突变鉴定，归纳如下：　　2.1直接顺序法对突变高发区城序列分析是鉴定突变的

6、最直观可靠的方法，可以准确判定突变的有无及突变性质，也是其它快速间接鉴别方法的金标准。应用放射性同位素或荧光标记测序法，已发现许多突变位点及不同的氨基酸置换。突变在511-533这一区域内发生率达95％以上，其中以531，526，533，516四个位点最为常见[1～5]。s研究了流行病学特征和结核杆菌利福平耐药突变性质之间的内在联系，认为突变位点及性质与耐药模式及程度，IS6110图谱及地位来源等无明显相关关系。但Taniguechi[5]有不同意见，他研究结果表明513，526，531位点的突变导致对利福平高度耐药而其他位点则明显低度耐药或根本无耐药性。总之直接测序可以得

7、到突变详细资料，还可以对新发现突变进行鉴定，不足之处是仪器试剂昂贵，操作复杂，成本高，有放射性污染，不适于普遍推广应用。　　2.2多聚酶链式反应-单链构象多态性分析法（PCR-SSCP）其原理为根据在非变性聚丙烯酰胺凝胶中相同长度单链DNA片段泳动距离的改变判定单个碱基变异。由于利福平耐药突变只在特定区域内发生，而通过PCR方法扩增这段基因，直接电泳判定突变有无，大大简化了突变分析操作。Telenti[1]最先评估了放射性同位素标记PCR-SSCP方法的结核杆菌rpoB突变中的应用价值。所有利福平耐药菌株均成功地被