由一株放线菌产生的抑制vcam

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1、由一株放线菌产生的抑制VCAM【摘要】以VCAM-1为靶位点，使用含有荧光素酶报告基因的转染细胞株筛选模型从微生物的代谢产物中高通量筛选能够抑制VCAM-1表达的生物活性物质，以期找到能够治疗诸如类风湿性关节炎等免疫性疾病的新型药物。在筛选过程中使用有机溶媒萃取、ODS反相柱层析、HPLC制备等方法，从一株放线菌来源的发酵液中分离到了一个对测活用细胞株的荧光素酶报告基因的表达有较强抑制作用的化合物，其IC50为10.8μmol/L，经理化性质及NMR分析确定该化合物与1.4菌株670的发酵于500ml的三角瓶中装入10

2、0ml种子培养基(含2.4%淀粉，0.1%葡萄糖，0.3%蛋白胨，0.3%牛肉膏，0.5%酵母粉，0.4%CaCO3，pH7.0)，接种后28℃培养3d，按10%的接种量将一级种子接种于装有的100ml发酵培养基(含4.0%可溶性淀粉，2.0%脱脂大豆粉，0.05%FeSO4·7H2O，0.05%K2HPO4，0.03%KCl；pH6.5)的三角瓶中，28℃振摇培养6d。2结果与讨论2.1菌株670的形态学特征与菌株的分类菌株670的营养菌丝在合成和复合培养基上均生长丰富，菌丝体不易断裂。气生菌丝在燕麦牛肉膏琼脂和无机

3、盐-淀粉琼脂培养基上均生长旺盛。孢子链为直链可弯曲型(rectiflexibiletype)，每条孢子链含有20个以上的孢子。孢子为圆柱状，体积为1.1μm×0.7μm，表面光滑。没有发现孢子囊和带鞭毛的孢子。全菌株细胞的DAP异构体为LL-型，主要的甲基萘醌类物质为MK-9(H6)。营养菌丝在各种培养基上呈灰棕色到褐色，气生菌丝颜色为白色到灰色。在酪蛋白胨-酵母膏培养基中可产生可溶性色素。菌株对碳源的利用情况和生理学特征和分别见Tab.1和Tab.2。综合上述分类学特征，将菌株670归属至链霉菌属。2.2菌株670产

4、生的活性化合物的分离纯化菌株670的发酵液3000ml于3000r/min离心15min，得上清液2300ml，菌体410g。上清液用2300mlEtOAc抽提二次，EtOAc层经无水Na2SO4脱水后减压浓缩抽干得茶色油状物318mg。菌体用500ml丙酮抽提一次，3000r/min离心15min，取上清减压抽去丙酮得水溶液350ml，水溶液用500mlEtOAc抽提两次，EtOAc层用无水Na2SO4脱水，减压浓缩抽干得茶色油状物173mg。菌体和上清EtOAc抽提物共490mg上ODS柱(ODS干重250g，用3

5、0%CH3平衡)，分别用30%、45%、60%、80%和100%CH3各50ml洗脱，5ml/管收集洗脱液。测各管活性(Fig.1)，收集合并活性峰A和B。减压抽干分别得浅黄色物质62.7和10.6mg。混合物A经HPLC分离(Fig.2，层析柱：YMC-PakODSAMφ20mm×300mm，流速6ml/min，流动相25%CH3，检测波长220nm)得活性化合物b(10.7mg)。2.3化合物b的抗菌活性取1mg/ml的活性化合物b的溶液(用50%甲醇配制)10μl滴于直径6mm的纸片上，用琼脂糖平板扩散法测得的抗

6、菌谱见Tab.3，该化合物仅对Pyriculariaoryzae显示出一定的抗菌活性(Tab.3)。2.4活性化合物b对荧光素酶报告基因表达的抑制作用不同浓度的化合物b对荧光素酶报告基因表达的抑制作用活性测定结果见Fig.3，其IC50值为10.8μg/ml。由Fig.3得知，化合物b对荧光素酶的表达有较强的抑制作用并具有剂量依赖性。2.5化合物b的理化性质和化学结构利用HPLC制备得到的化合物b为白色无定形粉末，呈现弱酸性，可溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮和氯仿，几乎不溶于水。从质谱分析得知该化合物的分子量为577，分子式

7、为C31H47O9N。用5mol/LHCl在60℃水解20min并用气相色谱分析得知有D-葡萄糖产生。该化合物的理化性质见Tab.4。综合化合物b的理化性质、通过检索相关的化合物数据库，发现该化合物与1987年Mastumoto等［17］报道的化合物的理化性质非常相似，在此基础上，通过对比化合物b与