人乳头瘤病毒16 l1-cea ctl表位融合蛋白的原核表达研究论文

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1、人乳头瘤病毒16L1/CEACTL表位融合蛋白的原核表达研究论文张德意朱冠保，张丽芳，朱珊丽，陈俊【摘要】目的:构建人乳头瘤病毒（HPV）16型衣壳蛋白L1与癌胚抗原（CEA）细胞毒T细胞（CTL）表位嵌合基因，探讨其在原核表达系统中的表达情况。方法:选择CEACTL表位（CEA691IMIGVLVGV），以HPV16阳性宫颈癌组织提取的DNA为模板，通过PCR方法扩增出HPV16L1/CEACTL表位嵌合基因，克隆入pET32a(+)表达载体.freelericgeneofHPV16capsidproteinL1andCEACTLepitopeandtoexplor

2、etheproteinexpressionofitinEscherichiacoli.Methods:TheCEACTLepitope（CEA691IMIGVLVGV）ericgeneofHPV16L1/CEACTLepitopeplifiedbyPCR.ThechimericgeneingthepET32a(+)/HPV16L1/CEACTLepitoperebinantedE.coliBL21.ThepET32a(+)/HPV16L1/CEACTLepitopefusionproteinnion-exchangechromatography.Theproteini

3、d,SDS-PAGEanalysisshoolecularmassofthisfusionproteinas83×103，edericgenecanbesuccessfullyexpressedinprokaryoticexpressionsystem,Itlaysthefoundationforthedetectingitsimmunityeffectiveness.Keyavirus;carcinoembryonicantigen;prokaryotiexpression;Tlymphocyte,lytotoxic癌胚抗原（carcinoembryonicanti

4、genCEA）是一种重要的肿瘤相关抗原，在绝大多数结直肠癌和胃癌、50%乳腺癌及70%非小细胞肺癌中有较高的表达1，2，以CEA抗原为基础的疫苗是目前防治CEA相关肿瘤研究的热点，而增强CEACTL表位的免疫原性仍是迫切需要解决的问题3，4。目前研究表明，人乳头瘤病毒（humanpapillomavirusHPV）结构蛋白L1可携带外源蛋白，是非常良好的抗原载体，能保持L1和外源蛋白的免疫原性和抗原性不变5。本研究利用HPV16L1作为CEACTL表位的载体，通过原核表达系统研究该嵌合蛋白的表达，为增强CEACTL表位疫苗免疫原性提供一条新的途径。1材料和方法1.1标

5、本来源宫颈癌标本来源于温州医学院第二附属医院妇产科，经PCR检测鉴定为HPV16阳性标本，由本室保存。1.2菌株和质粒pET32a(+)质粒菌株、大肠杆菌（E.coli）BL21(DE3)、DH5α菌株由本室保存，pMD18-Tvecter质粒购自TaKaRa公司1.3酶和试剂组织DNA提取试剂盒、DNAMarker(DL2000)和T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司；DNAMarker(λ/HindIII)、HindⅢ酶、BglⅡ酶、IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、Ni-NTA蛋白纯化胶、预染蛋白质Marker购自MBI公司；小规模质粒提取试剂盒和琼脂

6、糖胶DNA纯化回收试剂盒购自杭州维特洁公司；6×His单克隆抗体为ABR公司产品；辣根过氧化酶（HRP）标记山羊抗兔IgG(H+L)购于杭州联科生物公司；DAB显色剂购于北京赛驰生物科技有限公司。1.4HPV16L1DNA的提取用组织DNA提取试剂盒从本实验室保存的宫颈癌组织中提取HPV16DNA。1.5引物设计与合成根据HPV16DNA序列设计特定引物，同时根据pET32a(+)质粒引入酶切位点。正向引入的酶切位点为BglⅡ（AGATCT），反向引入的酶切位点为HindⅢ（AAGCTT）。正向引物为5'GAAGATCTGATGCAGGTGACTTTTATTTAC3'

7、，反向引物为5'CCCAAGCTTAACCCCAACCAGCACTCCAATCATGATCAGCTTACGTTTTTTGCG3'。引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。1.6HPV16L1/CEACTL表位嵌合基因的扩增以HPV16DNA为模板，用上述设计的引物通过PCR扩增出HPV16L1/CEACTL表位嵌合基因。PCR反应体系：HPV16DNA模板1μl，引物各0.5μl，PCR反应液25μl，双蒸水23μl，共50μl；PCR反应条件：95℃预变性10min；然后95℃变性，50s，53℃退火50s，72℃延伸80s，循环34次；再72