炭疽杆菌的快速鉴定.doc

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1、炭疽杆菌的快速鉴定王艺钧10生物技术3班201030700326摘要炭疽杆菌（Bacillusanthraci）属于需氧芽胞杆菌属，能引起羊、牛、马等动物及人类的炭疽病。炭疽杆菌曾被帝国主义作为致死战剂之一。平时，牧民、农民、皮毛和屠宰工作者易受感染。皮肤炭疽在我国各地还有散在发生，不应放松警惕。我们利用炭疽杆菌的特性，通过微生物学检查，观察炭疽杆菌在含血平板上幼稚菌落待征、溶血和粘性,再进行高价效噬菌体快速裂解试验、青霉素纸片串珠试验和活性炭NaHC03平板CO2培养物的荚膜肿胀试验,可在短时间内完

2、成对炭疽杆菌的定性鉴定，而不需要对其深入分子水平的检测。1．立项依据与研究内容1.1项目的立项依据炭疽热是一种古老的人兽共患传染病。炭疽是由炭疽杆菌引起的人兽共患急性、热性、败血性传染病。其病理变化的特点是脾脏显著肿大，皮下及浆膜下结缔组织出血浸润，血液凝固不良，呈煤焦油样。人感染后多表现为皮肤炭疽、肺炭疽及肠炭疽，偶有伴发败血症。人类炭疽病是由于接触病畜的皮毛、吸入带病菌（芽孢型）尘埃，或进食未煮熟的病畜肉类而感染。该病潜伏期约7天，但彻底发病多达60天，早期症状包括咳嗽，但很快会发展为严重的呼吸障

3、碍和痉挛。由于炭疽病起初的症状类似流感，非常容易被人忽略。一旦发病，病人在几天内就会死亡。因此，快速检测出炭疽杆菌和有炭疽杆菌引起的症状的辨别对临床和治疗有着重大的意义。如今，炭疽杆菌的鉴别技术已近很成熟，如：免疫学检验技术、核酸检验技术、适配子、肽核酸、生物传感器、生物芯片、化学分析技术、核酸测序与指纹图分析技术等等[2]。1.2项目的研究内容1.2.1炭疽杆菌的特点革兰氏阳性细菌；长而直的大杆菌，菌体两端平直；大小为1.0～1.5um×3～5um，致病菌中最大的；无鞭毛，不能运动。在病人、病畜体内

4、多散在或呈2～3个短链排列，有荚膜（红色）。炭疽杆菌为兼性需氧菌，在12～44℃都能生长，最适生长温度为37℃。最适pH为7.3～7.6。在活炭疽病畜体或死亡后未经解剖的尸体内，不形成芽胞。一旦体内炭疽杆菌暴露于空气中，接触了游离氧，在一定温度下(12--42℃)就会形成芽胞。芽胞呈卵圆形或圆形，位于菌体中央或稍偏向一端。1.2.2分离特性从临床患者和病畜标本中分离炭疽芽孢杆菌是比较简便的,但从环境样品中分离和鉴定芽孢则相对较困难,主要是缺乏有效的富集方法,环境样品中含有其它形成芽孢的需氧菌,它们的过

5、度生长可干扰芽孢发芽或干扰检测。气溶胶释放后,对污染区人或动物的采样,采集鼻腔、面部、头发内的样品最为重要。芽孢的如下特性有利于芽孢从环境样品中的分离[3]:①芽孢耐热:样品前处理时可以加热63～65℃20min杀死大部分繁殖体,并促进芽孢发芽;②芽孢耐乙醇:样品前处理时可以用50%乙醇处理1min杀死大部分繁殖体,因此从环境样品中分离芽孢并不受细菌繁殖体污染的干扰;③芽孢的浮力较大:我们可以用蔗糖或双相甘油-水分离芽孢。另外,芽孢的疏水性使之与土壤颗粒结合紧密,给分离带来了困难,因此,分离芽孢时一般

6、用非离子型去垢剂减少这种紧密结合,提高分离效率。分离后的炭疽杆菌接种到LB培养基，注意无菌低温4度保存，以备鉴定。1.2.3培养特性炭疽杆菌幼稚菌落:(1)呈典型狮子头状,边缘不整齐,常有小尾突起,(2)均不溶血;(3)菌落有粘性,用接种针挑取,拉丝现象明显。选择这样的典型菌落是顺利进行菌种鉴定的先决条件。因此必须控制分离平板的孵育时间。血平板在37℃中孵育12~15小时即可，孵育时间愈长,炭疽杆菌在平板上的菌落特征愈不明显。在碳酸氢钠的培养基中，孵育于CO2环境下，也能形成荚膜，形成荚膜是毒性特征，

7、有毒株在碳酸氢钠平板，20%CO2培养下，形成粘液状菌落（有荚膜），而无毒株则为粗糙状。在普通琼脂平皿培养基上生长成不透明、灰白色、扁平、表面粗糙的菌落，边缘不整齐，能形成几个或数十个菌体相连的长链，低倍显微镜观察呈卷发状。在血液琼脂平皿培养基上，生长出湿润粘稠的菌落，菌落周围不溶血。1.2.4最终鉴定在大多数情况下,炭疽芽孢杆菌的鉴定是比较容易的。血琼脂培养基上的菌落形态具有很重要的鉴定意义,例如,表面无光泽、菌落扁平、白色或灰白色、不溶血及边缘呈卷发状等;如果加上其它一些培养特征,如无动力、青霉素

8、敏感、噬菌体裂解、在含碳酸氢钠的血琼脂培养基(5%～20%CO2)上形成荚膜等,就可以认为这一菌株是具有毒力的炭疽芽孢杆菌,其余的生化测试意义不大。而通过PCR技术扩增荚膜和毒素基因也可以达到鉴定的目的[1]。对不典型荚膜可以用McFadyeans’s试验鉴别:将可疑菌落与数毫升血液混匀,37℃孵育4小时,然后做血涂片,热和酒精固定后,用亚甲蓝(Poly2chromeemthyleneblue)染色,炭疽芽孢杆菌染成黑色,荚膜染成粉红色。虽然已发现一些炭