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1、炭疽杆菌的快速鉴定王艺钧10生物技术3班201030700326摘要炭疽杆菌（Bacillusanthraci）属于需氧芽胞杆菌属，能引起羊、牛、马等动物及人类的炭疽病。炭疽杆菌曾被帝国主义作为致死战剂之一。平时，牧民、农民、皮毛和屠宰工作者易受感染。皮肤炭疽在我国各地还有散在发生，不应放松警惕。我们利用炭疽杆菌的特性，通过微生物学检查，观察炭疽杆菌在含血平板上幼稚菌落待征、溶血和粘性,再进行高价效噬菌体快速裂解试验、青霉素纸片串珠试验和活性炭NaHC03平板CO2培养物的荚膜肿胀试验,可在短时间内完成对炭疽杆菌的定性鉴定，而不需要对其深入分子水平的检测。1．立项依据
2、与研究内容1.1项目的立项依据炭疽热是一种古老的人兽共患传染病。炭疽是由炭疽杆菌引起的人兽共患急性、热性、败血性传染病。其病理变化的特点是脾脏显著肿大，皮下及浆膜下结缔组织出血浸润，血液凝固不良，呈煤焦油样。人感染后多表现为皮肤炭疽、肺炭疽及肠炭疽，偶有伴发败血症。人类炭疽病是由于接触病畜的皮毛、吸入带病菌（芽孢型）尘埃，或进食未煮熟的病畜肉类而感染。该病潜伏期约7天，但彻底发病多达60天，早期症状包括咳嗽，但很快会发展为严重的呼吸障碍和痉挛。由于炭疽病起初的症状类似流感，非常容易被人忽略。一旦发病，病人在几天内就会死亡。因此，快速检测出炭疽杆菌和有炭疽杆菌引起的症状
3、的辨别对临床和治疗有着重大的意义。如今，炭疽杆菌的鉴别技术已近很成熟，如：免疫学检验技术、核酸检验技术、适配子、肽核酸、生物传感器、生物芯片、化学分析技术、核酸测序与指纹图分析技术等等[2]。1.2项目的研究内容1.2.1炭疽杆菌的特点革兰氏阳性细菌；长而直的大杆菌，菌体两端平直；大小为1.0～1.5um×3～5um，致病菌中最大的；无鞭毛，不能运动。在病人、病畜体内多散在或呈2～3个短链排列，有荚膜（红色）。炭疽杆菌为兼性需氧菌，在12～44℃都能生长，最适生长温度为37℃。最适pH为7.3～7.6。在活炭疽病畜体或死亡后未经解剖的尸体内，不形成芽胞。一旦体内炭疽杆
4、菌暴露于空气中，接触了游离氧，在一定温度下(12--42℃)就会形成芽胞。芽胞呈卵圆形或圆形，位于菌体中央或稍偏向一端。1.2.2分离特性从临床患者和病畜标本中分离炭疽芽孢杆菌是比较简便的,但从环境样品中分离和鉴定芽孢则相对较困难,主要是缺乏有效的富集方法,环境样品中含有其它形成芽孢的需氧菌,它们的过度生长可干扰芽孢发芽或干扰检测。气溶胶释放后,对污染区人或动物的采样,采集鼻腔、面部、头发内的样品最为重要。芽孢的如下特性有利于芽孢从环境样品中的分离[3]:①芽孢耐热:样品前处理时可以加热63～65℃20min杀死大部分繁殖体,并促进芽孢发芽;②芽孢耐乙醇:样品前处理时
5、可以用50%乙醇处理1min杀死大部分繁殖体,因此从环境样品中分离芽孢并不受细菌繁殖体污染的干扰;③芽孢的浮力较大:我们可以用蔗糖或双相甘油-水分离芽孢。另外,芽孢的疏水性使之与土壤颗粒结合紧密,给分离带来了困难,因此,分离芽孢时一般用非离子型去垢剂减少这种紧密结合,提高分离效率。分离后的炭疽杆菌接种到LB培养基，注意无菌低温4度保存，以备鉴定。1.2.3培养特性炭疽杆菌幼稚菌落:(1)呈典型狮子头状,边缘不整齐,常有小尾突起,(2)均不溶血;(3)菌落有粘性,用接种针挑取,拉丝现象明显。选择这样的典型菌落是顺利进行菌种鉴定的先决条件。因此必须控制分离平板的孵育时间。
6、血平板在37℃中孵育12~15小时即可，孵育时间愈长,炭疽杆菌在平板上的菌落特征愈不明显。在碳酸氢钠的培养基中，孵育于CO2环境下，也能形成荚膜，形成荚膜是毒性特征，有毒株在碳酸氢钠平板，20%CO2培养下，形成粘液状菌落（有荚膜），而无毒株则为粗糙状。在普通琼脂平皿培养基上生长成不透明、灰白色、扁平、表面粗糙的菌落，边缘不整齐，能形成几个或数十个菌体相连的长链，低倍显微镜观察呈卷发状。在血液琼脂平皿培养基上，生长出湿润粘稠的菌落，菌落周围不溶血。1.2.4最终鉴定在大多数情况下,炭疽芽孢杆菌的鉴定是比较容易的。血琼脂培养基上的菌落形态具有很重要的鉴定意义,例如,表面
7、无光泽、菌落扁平、白色或灰白色、不溶血及边缘呈卷发状等;如果加上其它一些培养特征,如无动力、青霉素敏感、噬菌体裂解、在含碳酸氢钠的血琼脂培养基(5%～20%CO2)上形成荚膜等,就可以认为这一菌株是具有毒力的炭疽芽孢杆菌,其余的生化测试意义不大。而通过PCR技术扩增荚膜和毒素基因也可以达到鉴定的目的[1]。对不典型荚膜可以用McFadyeans’s试验鉴别:将可疑菌落与数毫升血液混匀,37℃孵育4小时,然后做血涂片,热和酒精固定后,用亚甲蓝(Poly2chromeemthyleneblue)染色,炭疽芽孢杆菌染成黑色,荚膜染成粉红色。虽然已发现一些炭
