蛭龙活血通淤胶囊对大鼠急性脑梗塞缺血-再灌注后神经细胞凋亡及相关基因表达的影响论文

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1、蛭龙活血通淤胶囊对大鼠急性脑梗塞缺血/再灌注后神经细胞凋亡及相关基因表达的影响论文.freelg/kg)腹腔麻醉后，仰卧固定在手术台上，颈部备皮，常规消毒后行正中切口，暴露右侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉((ICA)和颈外动脉(ECA)。在近心端结扎CCA，远心端挂线备用。在CCA分叉处结扎ECA;ICA近分叉处备线并打一活结，ICA远端用微动脉夹夹闭;距CCA分叉0.5cm处将CCA剪一小口，插入直径0.2mm的线栓，收紧备线，打开动脉夹，栓线进入ICA，轻柔推进，当线端进入18～21mm时可感到有一定阻力即停止推送。此时栓线头端正好位于大脑中动脉(MCA)起始

2、部，阻断了MCA的血流。缺血1h后，拔出线栓，扎紧备线，固定纤维缝合，切口局部以甲硝唑冲洗消毒，每只大鼠注射1ml(4万u)庆大霉素以预防感染。假手术组除不插入线栓外，其余步骤同模型组。术中体温用烤灯维持在37～37.5℃。正常对照组无任何处理。造模后的动物在自然苏醒后，出现右侧Horner征，提尾左前肢内收屈曲，爬行时向左侧划圈者为手术成功的标志。2.2药物干预大鼠于缺血1h再灌注24h后给予蛭龙活血通瘀胶囊灌胃2g/(kg·d)，连续7d。步长脑心通组给予步长脑心通灌胃，2g/(kg·d)，连续7d。假手术组、模型组大鼠均给相同体积的蒸馏水灌胃。2.3神经功能

3、缺损评分进行两次神经功能缺损评分，于造模成功后第1天进行神经功能缺损评分，治疗、观察7d后再进行1次。按Bederson评分标准评分，0级(0分)：无神经功能障碍;1级(1分)：提大鼠尾，见瘫痪侧前肢回收屈曲不能正常伸向地面;2级(2分)：除1级体征外，向瘫痪侧推时感阻力较对侧明显降低;3级(3分)：除以上体征外，大鼠爬行时向瘫痪侧旋转。2.4免疫组化每组随机取8只大鼠行免疫组化。2.4.1组织灌注与固定简要手术步骤如下：6%的水合氯醛(5ml/kg)腹腔注射麻醉。经心脏灌注肝素化生理盐水(37℃)10min，然后4%的多聚甲醛350ml持续灌注30min。取脑后

4、用4%的多聚甲醛后固定6h行梯度脱水与石蜡包埋。2.4.2神经细胞凋亡及Bcl-2与Caspase-3基因表达测定采用原位末端标记法(TUNEL)检测伤侧皮层、海马区神经细胞凋亡情况，采用免疫组化法测定Caspase-3的表达，应用图像分析处理系统对染色强度的灰度进行定量分析。2.4.3计算机图像分析将切片于光镜下放大400倍，通过计算机图象分析仪，每张切片随机选择10个视野，测定阳性染色的平均光密度与阳性细胞百分比(指阳性细胞占视野中所有细胞数的百分比)，分别计算：①细胞凋亡指数(AI)=(%)=平均光密度×阳性细胞百分比×100;②蛋白阳性表达指数(PEI)=

5、(%)=平均光密度×阳性细胞百分比×100%。2.5统计学处理计量资料以±s表示，使用SPSS13.0软件进行统计学处理，组间差异采用方差分析，两两对比采用t检验。取P0.05作为显著性差异水平。3结果3.1神经功能缺损程度治疗后神经功能缺失评分假手术组为0分，蛭龙活血通淤胶囊治疗组为(1.78±1.03)分，步长脑心通治疗组为(1.80±1.15)分，两组均显著低于模型组的(2.90±1.10)分(0.013.2组织病理学变化光镜下假手术组大鼠皮层各层细胞排列整齐，神经元结构完整，神经基质无水肿，基底神经节区神经元结构正常，神经纤维无损坏，模型组大鼠病理改变为神

6、经元结构模糊，胞体肿胀，胞核淡染，核固缩，尼氏小体减少或消失等变化;蛭龙活血通瘀治疗组与步长脑心通对照组见大脑皮质锥体细胞和脑实质神经细胞结构清楚，核固缩、核溶解程度较局灶脑缺血对照组明显减轻，病变范围明显缩小。3.3凋亡细胞和Bcl-2、Caspase-3蛋白表达检测结果光镜下TUNEL染色阳性的凋亡细胞为圆形或椭圆形，细胞核或胞浆中有棕色颗粒，核染色质浓聚呈边聚观象，似月牙形，有时可见细胞膜皱褶，以及芽生形成膜包裹的凋亡小体。阳性细胞呈簇状或散在分布于梗塞灶边缘区域。假手术组脑组织TUNEL染色只有零星的细胞凋亡，而模型组凋亡细胞略有增多，蛭龙活血通淤治疗组与

7、步长脑心通对照组较模型组凋亡细胞明显减少(P0.01)。光镜下Bcl-2阳性细胞核膜和胞浆呈棕黄色。假手术组可见少量表达，模型组较假手术组增多(P0.01)，多分布在缺血周围区域，而病灶中心未见阳性细胞。蛭龙活血通淤治疗组与步长脑心通对照组表达最多，与模型组及假手术组比较有显著性差异(P0.01)。光镜下Caspase-3阳性细胞胞浆、胞核均着色，呈均匀弥漫棕黄色染色，多分布于缺血周围区域，蛭龙活血通淤治疗组与步长脑心通对照组Caspase-3阳性细胞的表达均明显少于模型组(P0.01)。结果见表1。表1各组神经功能评分及神经细胞凋亡指数4讨论近年来细胞凋亡与脑梗

8、塞的关系越