三七总皂甙诱导脐血单个核细胞分化为内皮细胞

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1、三七总皂甙诱导脐血单个核细胞分化为内皮细胞【摘要】为了研究三七总皂甙(totalpanaxnotoginsengsaponins,tPNS)对脐血单个核细胞诱导出内皮细胞的影响,采用含三七总皂甙的DMEM对脐血单个核细胞进行诱导，用光学显微镜和荧光显微镜观察细胞形态，流式细胞术检测细胞表面标记UEA1、功能标志vononuclearCellsinHumanCordBloodintoEndothelialCellsAbstractToinvestigatetheeffectoftotalpanaxnotoginsengsaponins（tPNS）toinduc

2、ethedifferentiationofmononuclearcells(MNC)incordbloodintoendothelialcells，theDMEMculturemediacontainingtPNSorphologyoftheadherentcellsicroscopyandthefluorescencemicroscopy,thechangesofcellsurfacemarkers(UEA1),functionmarker(vNCinthecordbloodtodifferentiateintoendothelialcells.Nosyn

3、ergisticeffecthasbeenfoundbetononuclearcell;endothelialcell三七总皂甙（totalpanaxnotoginsengsaponins,tPNS）是我国中药田三七的主要药用成分，主要含人参二醇型皂甙Rb1、人参三醇型皂甙Rg1和生物碱等成分，能特异性地阻断受体操纵性的钙离子通道，具有扩张血管、降低心脏后负荷、减少心肌耗氧量和心律失常的作用，常用于治疗中风、脑缺血等疾病［1］，还可使心肌缺血区面积明显缩小［2］。微循环的改善与内皮细胞的形成和功能密切相关，内皮细胞的生成是血管新生的基础，在机体病理生理过程中具

4、有重要作用。本实验通过使用tPNS诱导脐血部分单个核细胞分化为内皮细胞，探讨tPNS对内皮细胞形成的作用。材料和方法材料和试剂脐血来源于本院妇产科健康足月妊娠产妇（顺产）脐带血，肝素抗凝。tPNS购自北京生物制品检定所，内皮细胞黏附因子购自CascadeBiologics公司，FITC标记的Ⅰ型荆豆凝集素（Ulexeuropaeusagglutinin1，UEA1）购自Sigma公司，FITC标记的抗人CD31单克隆抗体购自eBioscience公司，FITC标记的抗人vEM购自Gibco公司，胎牛血清购自北京元亨圣马生物研究所，EpicsXL型流式细胞仪

5、为美国Coulter公司产品。用Ficoll淋巴细胞分离液（比重1.077）分离脐血单个核细胞并培养于含有10%胎牛血清，100U/ml的青霉素，100U/ml链霉素的DMEM中，调整细胞数至1×106/ml置入培养瓶中，在含37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养24小时。培养24小时前、后单个核细胞UEA1和CD31阳性率的测定取分离出的脐血单个核细胞悬液(1×106/ml)100μl，分别加入UEA1FITC、CD31FITC各20μl，室温避光孵育30分钟，再用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞2次，加1mlPBS重悬细胞，立即在流式细胞仪上检测

6、UEA1和CD31阳性率。取培养24小时后未贴壁的细胞悬液，按上述方法制备，检测UEA1和CD31阳性率，同培养前进行比较。不同浓度tPNS诱导脐血单个核细胞分化为内皮细胞的检测在24孔培养板各孔中加入0.1%内皮细胞黏附因子0.5ml，37℃静置30分钟，待培养板底部形成明胶膜后吸弃上清液。将培养24小时后未贴壁的脐血单个核细胞进行细胞计数，调整细胞浓度至（1-2）×106/ml，每孔加入0.5ml细胞悬液，接种于培养板中，然后分别加入终浓度为0、125、250、500、1000、2000mg/L的含tPNS的DMEM，每个浓度取4个平行孔，重复5次。培

7、养72小时后，各组均换成不含tPNS的DMEM，每48小时半量换液，培养至第7天，倒置显微镜下观察每孔细胞的形态。弃去培养液，用PBS液洗3次，再用0.25%胰蛋白酶消化后洗下贴壁细胞进行细胞计数。贴壁细胞结合UEA1阳性率的流式细胞术检测培养至第7天吸弃悬浮细胞，将各组培养所得贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化，离心，洗涤，用流式细胞仪检测并比较各组贴壁细胞结合UEA1的阳性率。贴壁细胞的表面标记及形态鉴定以tPNS终浓度为250mg/L的DMEM诱导脐血单个核细胞，培养至第7天将部分贴壁细胞洗下行流式细胞仪检测（结合UEA1阳性率，表达CD31阳性率，

8、表达vEM。培养72小时，各组均换成D