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1、哮喘豚鼠气道重构中基质金属蛋白酶论文王光辉，金发光，楚东岭，段丽【关键词】哮喘；气道重构；明胶酶B；金属蛋白酶1组织抑制剂【Abstract】AIM:Toinvestigatetherolesofmatrixmetalloproteinase9(MMP9)andtissueinhibitorofmetalloproteinase1(TIMP1)inairodelingofasthmaricguineapigs.METHODS:Guineapigsinconjunctedinaerosol.Theguineapigslydividedintothecont
2、rolgroup，asthmatic4,6,8munohistochemistrybinedicroimageanalysis．ThelevelsofMMP9mRNAandTIMP1mRNAinedbysemiquantitativePCR.RESULTS:①Afterrepeatedallergenchallenge,smoothmusclehyperplasiaaticanimalsthanthoseofcontrolgroup．②TheexpressionofMMP9inasthmaticguineapigslungtissuesaticguine
3、apigslungtissuesmunocytochemistryaticanimals.SoratioofMMP9/TIMP1aairodeling,andtheratioofMMP9/TIMP1mayreflectethedegreeofasthmaairodeling.【Keya;airodeling;gelatinaseB;tissueinhibitorofmetalloproteinase1【摘要】目的：探讨哮喘豚鼠模型中基质金属蛋白酶（MMPs）及其组织抑制因子(TIMP)在哮喘气道重构发病中的作用.方法：重复雾化吸人卵蛋白建立豚鼠哮喘气道重
4、构模型.实验分为对照组、哮喘激发4,6和8RNA水平.结果：①哮喘各组动物均出现管壁增厚、平滑肌增生等气道重构的特征性改变.②哮喘豚鼠MMP9的mRNA表达：哮喘4RNA水平：哮喘4atrix,.freelatrixmetalloproteinases,MMP9)与基质金属蛋白酶抑制因子1（tissueinhibitorofmetalloproteinase,TIMP1）平衡是维持ECM内环境稳定的决定因素［2］.本实验通过复制豚鼠哮喘模型,利用免疫组化和RTPCR方法测量不同阶段哮喘豚鼠模型肺中MMP9及TIMP1含量变化,并了解MMPs/TIMP在哮
5、喘发病中的作用.1材料和方法1.1材料卵蛋白、结合生物素的羊抗兔IgG血清、ABC复合物均购自美国Sigma公司；兔抗TIMP1抗体、兔抗MMP9抗体购自武汉博士德公司；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；Taq酶购自日本Promega公司；MMP9和TIMP1上下游引物由北京奥科公司合成；402型超声雾化吸入器购自上海合力医疗器械厂；PTC100型PCR仪为美国BioRab公司产品；雄性豚鼠32只，体质量200～250g，由第四军医大学试验动物中心提供.1.2方法1.2.1动物分组及模型制备实验动物随机分为对照组和哮喘4，6和8g，1in
6、，根据分组分别激发4，6和8in，甚至更长；对照组同样于第1日腹腔注射生理盐水0.9mg，1in，隔日1次，雾化吸入生理盐水8g/kg）麻醉豚鼠，开胸留取豚鼠左肺置于液氮中速冻，-70℃保存备用，经肺动脉灌注100mL生理盐水,继以新配制的40g/L多聚甲醛PBs（0.1mol/L，pH7.4）600mL持续灌注90min,并将右肺取下后固定24h,入200g/L蔗糖+含氟PB溶液中，4℃过夜至标本下沉，OCT包埋，恒冷箱切片机连续切片（厚15μm），-20℃保存备用.1．2．3免疫组化染色肺组织切片贴于载玻片上,室温干燥30min后,以0.01mol/
7、LKPBS(pH7.4)浸洗,经800mL/L甲醇+30mL/LH2O2封闭15min，KPBS浸洗3次×10min,切片入兔抗MMP9血清(1∶100)室温孵育24h.KPBS浸洗3次×10min，入结合生物素的羊抗兔IgG血清(1∶500),室温孵育2h，KPBS浸洗3次×10min,入ABC复合物(1∶500)室温孵育2h，葡萄糖氧化酶DAB硫酸镍胺法显色.显色反应终止后，常规脱水,中性树胶封片.同样方法利用兔抗TIMP1染色切片.每张切片在显微镜下随机选取5个支气管，以棕黄色颗粒在胞质的沉积为阳性.图像分析各支气管细胞染色的平均密度以代表MMP9
8、,TIMP1的表达强度.1．2．4MP9及TIMP1半定量PCR用Trizol试
