水通道蛋白4在急性实验性脊髓损伤中的表达论文

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1、水通道蛋白4在急性实验性脊髓损伤中的表达论文.freelRNA的表达变化。结果脊髓损伤后AQP4及其mRNA表达即开始增加并持续上升，伤后3d达到高峰，以后逐渐减少，二者的表达变化呈显著正相关。结论AQP4参与了脊髓损伤后水肿的形成过程，AQP4过度表达可能是损伤性脊髓水肿的分子生物学机制之一。【关键词】水通道蛋白4；免疫组化RTPCR；脊髓损伤；脊髓水肿急性脊髓损伤(acutespinalcordinjury，ASCI)临床上常见.freelRNA的表达变化规律，并对脊髓损伤后AQP4的表达与脊髓水肿的相关性进行分析，

2、进一步探讨损伤性脊髓水肿的分子生物学机制。1材料与方法1.1材料4～5个月龄健康雄性新西兰大耳白兔48只，体重2.1～3.2kg，平均2.7kg。根据脊髓损伤造模成功后6h、1、3、5、7d五个时间点随机分成实验1～5组以及对照组，每组平均8只。主要试剂：抗兔AQP4抗体(博士德)；免疫组织化学检测试剂盒及DAB浓缩显色液(迈新)。1.2方法1.2.1建立急性不完全性脊髓损伤模型3%戊巴比妥钠30mg/kg静脉麻醉。咬除兔T12棘突和椎板修剪成直径约0.4cm的圆形骨窗，显露脊髓，在硬膜表面放置与骨窗直径一致的塑料垫片，用

3、自制的改良Allen装置制备脊髓损伤动物模型。实验组参照预试验结果从3cm高处击打，致伤能量60gcm。造模成功标志：实验兔双后肢抽动后弛缓瘫。对照组只暴露脊髓节段，不打击脊髓。1.2.2脊髓标本的采取实验组动物按照分组时间点、对照组动物于术后3d分别处死，以骨窗为中心，切取1.0cm的脊髓段。将脊髓标本从中心点一分为二，一半于－70℃低温保存，备RTPCR之用；另一半于4%多聚甲醛固定液中固定24h后用蒸馏水清洗12h，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、4μm连续切片行免疫组织化学染色。1.2.3脊髓损伤不同时段AQ

4、P4的表达切片常规脱蜡，3%H2O2室温浸泡10min以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗，PBS洗；滴加正常血清封闭20min，弃血清，直接加一抗，室温下孵育过夜，PBS充分洗；滴加二抗室温下30min，PBS充分洗；DAB显色镜下控制，自来水充分洗；苏木素染核，脱水透明，封片光镜观察。对照实验：取相同量的正常血清代替AQP4抗体，其余步骤同前。光镜下细胞膜上出现棕黄色颗粒为AQP4免疫阳性细胞。光学显微镜下观察切片，每只兔共染色3张切片，随机选择4处灰白质阳性表达区，用图像分析仪测量脊髓损伤不同时段平均光密度(OD)值，3

5、张切片的均值为该只兔脊髓AQP4表达的OD值。1.2.4RTPCR检测脊髓损伤不同时段AQP4mRNA的表达不同实验组和对照组脊髓组织各50mg进行RTPCR分析，按Trizol试剂说明提取组织总RNA；采用MMLV逆转录试剂盒按操作说明逆转录成cDNA；产物进行PCR扩增。参照基因库基因序列设计引物，AQP4引物上游序列5′TTGGACCATCATAGGCGC3′，下游序列5′GCATGTGATCGACATTGACC3′，扩增片段长约214bp；GAPDH引物上游引物5′GGGTGATGCTGGTGCTGAG

6、TATGT3′，下游序列5′AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGTC3′，扩增片段长约700bp。RTPCR引物由联星公司合成。扩增条件：94℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸1min，反应30个循环后，接72℃延伸10min。PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像分析系统中观察并照相。1.3统计学处理采用SPSS11.0统计软件处理，所有数据均采用x±s表示，采用t检验分析，并分别对脊髓损伤不同时段AQP4染色表达OD值、AQP4mRNA的表达水平进行Pearson相关分析。2结果2.1

7、损伤脊髓的表达对照组脊髓AQP4在灰质和白质均有表达。脊髓灰质阳性细胞主要为神经胶质细胞，细胞膜呈棕黄色，顺中央管排列的室管膜细胞表达呈弱阳性，中央管室管膜周围、血管周围表达强烈，邻近毛细血管内皮细胞和神经元的胶质细胞突起表达亦非常丰富，神经元未见着色。脊髓白质内的纤维性星形胶质细胞、脊髓表面软脊膜也呈阳性表达，以邻近蛛网膜下腔和面向毛细血管内皮细胞的胶质细胞表现得更加突出。损伤早期中央管周围和后角染色较深，随着时间的延长损伤部位及其周围的水肿区AQP4表达明显增强，而脊髓中央出现坏死、空泡形成的区域反而表达减弱，甚至无表

8、达。实验1组，AQP4表达开始增加。实验3组，AQP4表达在损伤脊髓的水肿区达高峰，尤其在血管周围表达强烈，呈深棕色。随时间延长AQP4表达又逐渐减弱，实验5组表达仍稍高于正常水平。AQP4阳性表达主要位于损伤周围水肿区星形胶质细胞的细胞膜上，而胞浆及胞核未见阳性表达，镜下AQP4阳性细胞呈空泡状。2.