银杏叶提取物对胶质瘤细胞nfκb表达和no生成的调控

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1、银杏叶提取物对胶质瘤细胞NFκB表达和NO生成的调控【摘要】目的研究银杏叶提取物（EGb761）对C6胶质瘤细胞核转录因子κB（NFκB）表达和可诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、一氧化氮（NO）生成的影响。方法以脂多糖（LPS）和佛波酯（PMA）诱导体外培养的C6胶质瘤细胞表达可诱导型一氧化氮合酶、产生大量NO，应用激光共聚焦成像系统和NO荧光探针监测细胞内NO浓度变化，逆转录基因扩增技术和蛋白质印迹技术检测EGb761对C6胶质瘤细胞中iNOS基因表达的影响，并探讨这一调控作用的分子机制。结果EGb761能明显降低C6

2、胶质瘤细胞中iNOSmRNA和蛋白的表达、减少NO的生成，抑制IκBα的降解和阻止p65/RelA进入细胞核。结论EGb761可通过NFκB信号通路对C6胶质瘤细胞iNOS基因表达和NO的生成进行调控。【关键词】银杏叶提取物；胶质瘤细胞；可诱导型一氧化氮合酶；一氧化氮；核转录因子κBRegulatoryEffectofGinkgoBibobaExtractontheExpressionofNFκBandNitroxideProductioninGliomaCellsKeyacell；iNOS;Nitricoxide;N

3、FκB银杏为最古老的中生代孑遗稀有植物之一，属裸子植物门银杏纲银杏科植物，现仅存一科一属一种，有裸子植物“活化石”之称。银杏树的根、叶、皮及种子均可药用。银杏叶入药始于明代，传统医学用银杏叶治疗哮喘、支气管炎和老年性心血管疾病，但叶中含有氢氰酸，可加速心率，副作用大。20世纪60年代后，德、法等欧洲国家先后开展了对银杏叶的研究。1965年，德国威玛舒培博士(Dr.A诱导体外培养的C6细胞为实验模型，采用激光共聚焦、RTPCR、EM培养基、胎牛血清（Hyclone公司）；UNIQ10柱式总RNA提取纯化试剂盒（上海生工公司

4、）；AccessQuickTMRTPCR试剂盒（Promega公司）等；EGb761（法国BeaufourIpsen制药公司MarieThersesDroyLefaix博士惠赠）。实验仪器有：CO2培养箱（Napco，USA）；紫外分光光度计（Beckman，USA）；电泳仪（EPS301，USA）；PCR仪（Eppendorf，Germany）；凝胶成像系统（UVP，USA）；激光共聚焦扫描荧光显微镜（Olympus，Japan）等。1.2细胞培养将复苏的C6胶质瘤细胞混悬于DMEM培养基中（含10%灭活胎牛血清，10

5、0U/ml青霉素，100μg/ml链霉素），置37℃、含5%CO2的细胞培养箱内培养，待细胞长成单层后（约3d）按1∶4传代。1.3细胞内NO水平检测将处于对数生长期的C6细胞用0.1%的胰酶消化，用含10%胎牛血清的培养基重悬细胞，配成1×105的细胞悬液，接种于4cm培养皿中，每皿2ml，贴壁2h后换成无血清培养基，分为3组，即对照组、诱导组（LPS1μg/ml和PMA400ng/ml）和药物组（在加入LPS和PMA前2h加EGb76150μg/ml），12h后换成带DAF2DA探针（2.5μmol/L）的培养基，培养

6、1h，用培养基洗涤细胞3次，置显微镜下观察，激发波长488nm。1.4亚硝酸盐测定细胞接种于24孔培养板，1×105/孔，分为对照组、诱导组和药物组3组，对照组不加诱导剂和药物，诱导组加入诱导剂LPS（终浓度1μg/ml）和PMA（终浓度400ng/ml），药物组在加入诱导剂前2h先加入EGb761（终浓度50μg/ml），取上清培养液加入等量Griess试剂，室温放置10min，用BekmanDU640可见紫外分光光度计，在546nm处测定其吸光度A值，以亚硝酸钠为标准，绘制标准曲线，求出亚硝酸盐的含量，并换算成nmol

7、/L×105个细胞。1.5RTPCR分析分别提取各组总RNA，RTPCR试剂盒进行扩增以分析iNOS基因的mRNA表达，βactin为内参物。PCR引物设计参照2结果2.1EGb761抑制NO的合成对照组细胞荧光强度很弱，表明NO生成的量很少，见图1A；经诱导组细胞荧光强度明显增强，表明产生了大量NO，见图1B；药物组见图1C。提示EGb761对于C6胶质瘤细胞中NO的合成具有显著抑制作用。同时应用Griess反应测定培养液中NO的含量。对照组细胞产生的NO含量很低，诱导组细胞产生大量NO，在一定时间范围内随诱导时间的延

8、长而增多，而药物组C6细胞NO产量明显减少，两者差异有显著性（P＜0.01），见表1。表1胶质瘤细胞的一氧化氮产量2.2EGb761抑制iNOS的表达为了揭示EGb761抑制C6胶质瘤细胞中NO合成的分子机制，用RTPCR和蛋白质印迹分析分别从mRNA和蛋白水平检测了EGb