il23在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞rankl表达中的作用

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1、IL23在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞RANKL表达中的作用【摘要】目的探讨IL23在类风湿关节炎(RA)滑膜成纤维细胞核因子κB(NFκB)受体激活剂配体（RANKL）表达中的作用；并分析IL23诱导RANKL表达的信号传导通路。方法分离RA和骨性关节炎(OA)患者滑膜成纤维细胞，分别加入不同浓度的IL23(1、5和10ng/ml)，72h后，实时荧光定量PCR(FQPCR)法检测RANKLmRNA表达。为了研究RANKL表达的信号传导通路，在成纤维细胞中分别加入PD98059、Ly294002、AG490和Pathenolide孵育1

2、h，然后加入IL23刺激72h，FQPCR法检测RA患者RANKLmRNA表达水平。结果IL23能上调RA滑膜成纤维细胞RANKL表达；与之相反，IL23几乎不诱导OA患者成纤维细胞RANKL表达。加入PD98059、Pathenolide和AG490后，IL23诱导RA患者滑膜成纤维细胞RANKL的表达明显被抑制。结论IL23可能通过MEK1/2、NFκB和STAT3信号途径诱导RA滑膜成纤维细胞表达RANKL。【关键词】类风湿关节炎；RANKL；IL23；成纤维细胞；信号传导类风湿关节炎(RA)是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身

3、性自身免疫性疾病。滑膜炎持久反复发作，可导致关节内软骨和骨破坏，最终引起关节功能障碍甚至残废。尽管目前对RA软骨损伤和骨质破坏的发病机制尚未完全阐明，但大量相关试验表明，破骨细胞在RA骨破坏的病理过程中起关键作用〔1〕；而核因子κB(NFκB)受体激活剂配体(RANKL)是破骨细胞形成和分化过程中的必需因子〔2〕。RANKL表达受许多细胞因子和其他免疫因子的调控。已经证明，RA的外周血、滑膜及滑液中存在的炎性细胞因子如IL1β，IL6、TNFα及IL17等都能促进RANKL表达。IL23是2000年新发现的一个炎性细胞因子，具有十分复杂

4、的生物学功能，可通过分泌IL17促进RANKL上调〔3〕。但IL23能否直接作用于T细胞和滑膜细胞刺激RANKL生成及其信号传导途径尚不明确。本文将研究IL23对RA滑膜成纤维细胞RANKL表达的诱导作用，同时探讨IL23诱导RANKL表达的信号传导通路。　　1资料与方法　　1.1病例选择　　选取RA患者5例，均符合1987年美国风湿病协会(ACR)修订的RA分类诊断标准〔4〕。其中女4例，男1例，年龄32～70岁，平均(57±8)岁。另选取年龄与性别相匹配的4例骨性关节炎(OA)患者为对照组。所有患者标本取材于全膝关节置换术或经关节镜滑膜

5、切除术后的滑膜组织。　　1.2实验方法　　1.2.1成纤维细胞的分离与培养　　取做过关节手术的RA和OA患者的滑膜组织，切碎后用4mg/mlⅠ型胶原酶在37℃，5%CO2培养箱中消化4h，溶解后的细胞以500g离心，用含10％小牛血清的DMEM培养基过夜培养，次日去除非贴壁细胞，贴壁细胞用含10％小牛血清的DMEM培养基继续培养，每隔3d换液一次至细胞融合后传代，用4～8代的细胞进一步试验。　　1.2.2试剂　　重组人IL23购自RD公司；NFκB抑制剂（Pathenolide）购自Sigma；丝裂原激活的蛋白激酶(MEK1/2)抑制剂（PD9

6、8059），信号转导和转录激活剂(STAT3)抑制剂（AG490）和磷酰肌醇激酶3(PI3K)抑制剂（Ly294002）购自Calbiochem(德国Schm2的培养皿上，当细胞长满后，在不同的培养皿上加入不同浓度的IL23(1、5和10ng/ml)，在37℃，5%CO2培养箱中孵育72h，弃上清。在细胞中加入Trizol1ml裂解细胞提取RNA。在2.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，紫外分光光度计测量RNA含量。取2μgRNA，合成cDNA。　　1.2.4实时荧光定量PCR(FQPCR)检测RANKLmRNA表达水平　　根据GenBank中

7、检索到的人RANKL序列设计并合成引物。取上述cDNA2μl，每个样本3复孔，终体积25μl，使用QuantSYBRGreenPCRkit(美国ABI公司)进行PCR。PCR反应条件：95℃10min，扩增45个循环(95℃10s，59℃10s，72℃10s)。为了消除样本提取、逆转录和PCR反应过程中造成的差异，同时进行看家基因βactinmRNA表达的检测，△△Ct法比较RANKLmRNA表达水平。RANKL的引物序列为：上游5′ACCAGCATCAAAATCCCAAG3′，下游5′CCCCAAAGTATGTTGCATCC3′。　　1

8、.2.5IL23诱导RANKL表达的信号传导通路的研究　　把RA成纤维细胞接种在100mm2的培养皿上，当细胞长满后，在