复方五仁醇胶囊含药血清指纹图谱与保肝作用的谱效关系

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1、复方五仁醇胶囊含药血清指纹图谱与保肝作用的谱效关系窦志华，罗琳，丁安伟，王陆军，张兵，李民【摘要】目的：阐明复方五仁醇胶囊保肝作用的药效物质基础.方法：将大鼠灌胃给药分别制备复方五仁醇胶囊及五味子、三七、柴胡、叶下珠4味药的阴性制剂和单味制剂含药血清，对获得的9组含药血清按已经建立的指纹图谱条件进行HPLC测定，同时考察它们对CCL4诱导的损伤肝细胞的增值（MTT法）及丙氨酸氨基转移酶（ALT）泄漏的影响，最后进行谱效关系分析.结果：指纹图谱显示，单味五味子及三七、柴胡、叶下珠阴性制剂含药血清中均检测到大鼠灌服全方制剂后血液中产生的13个药源性成分，而五味子阴性制剂及单味三七、柴胡、叶下珠含

2、药血清中均未检测到药源性成分；药效结果显示，全方、单味五味子及三七、柴胡、叶下珠阴性制剂含药血清对肝细胞损伤均具有明显的保护作用，而单味三七、柴胡、叶下珠含药血清及五味子阴性制剂含药血清作用不明显，且单味五味子与全方制剂含药血清组之间药效无显著差异.谱效之间具有很好的相关性.结论：复方五仁醇胶囊保肝作用的药效物质基础主要来自君药五味子所含有的木脂素类成分.【关键词】复方五仁醇胶囊；含药血清；指纹图谱；保肝作用；谱效关系；色谱法，高压液相0引言　　中药血清药理学和血清药化学是一种很有发展前景的研究复方的新思路，两者的结合研究有助于中药药效物质基础的阐明［1］.复方五仁醇胶囊由五味子、三七、柴胡

3、及叶下珠等4味药组成，其中五味子为君药，是一种治疗慢性肝炎的科研制剂［2］，我们以该制剂为对象进行血清药理学与血清药化学相结合探寻中药复方药效物质基础的方法学探讨.我们曾采用正交试验法优选了该制剂含药血清制备条件，建立了以CCL4诱导的原代培养大鼠肝细胞损伤模型对含药血清进行药效评价的方法，并分别进行了体外制剂、含药血清的HPLC指纹图谱研究［3-4］.在此基础上，我们研究制备了全方制剂含药血清及拆方后的各组方药材阴性制剂和各单味制剂含药血清，分别对这9组含药血清按已经建立的指纹图谱条件进行HPLC测定和药效评价，试图通过谱效关系分析初步阐明该制剂保肝作用的药效物质基础.1材料和方法1.1材

4、料SD大鼠，SPF级，雌雄各半，体质量（248.4±16.3）g，南通大学实验动物中心提供，许可证号SYKX（苏）2002?0022；Agilent1100Series高效液相色谱仪（美国Agilent公司，包括G1311A四元泵，G1379A脱气装置，G1313A自动进样器，G1314AV21）；乙二醇双（2?氨基乙醚）四乙酸（EGTA，美国AMRESCO公司，批号0732）；胶原酶IV（美国Sigma公司，批号0406）；胰蛋白酶（美国Sigma公司，批号030702）；DMEM培养基（美国Gibco公司，批号1255136）；四氯化碳（宜兴市第二化学试剂厂，批号20010608）；溴化

5、3?(4,5?二甲基噻唑)?2,5?二苯基四氮唑蓝（MTT，美国AMRESCO公司，批号1324B37）；新西兰新生小牛血清（美国HyClone公司，批号DPEO166）；复方五仁醇胶囊及其各组方药材阴性制剂、单味制剂（南通大学附属南通第三医院，批号050505）；色谱纯甲醇（江苏汉邦科技有限公司）；色谱纯乙腈（美国TEDIA公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；其他试剂均为分析纯.1.2方法1.2.1含药血清和空白血清的制备按文献［4］方法制备大鼠含药血清和空白血清.1.2.2各组含药血清的HPLC测定按文献［4］方法制备大鼠含药血清和空白血清供试品溶液，并分别吸取含药血清、空白血清供

6、试品溶液20μL，注入高效液相色谱仪，记录70min色谱图.1.2.3原代肝细胞的分离培养、分组及处理大鼠用30g/L戊巴比妥钠以1.5mL/kg腹腔注射麻醉，背位固定，开腹，门静脉插管，以37℃无钙灌流液（组成：HBSS500mL，HEPES1.19g，EGTA0.095g，NaHCO30.175g，pH7.4）灌流约20min后，换用37℃的通氧胶原酶灌流液（组成：HBSS100mL，HEPES0.238g，CaCL20.07g，胶原酶IV0.075g，胰蛋白酶0.01g，NaHCO30.035g，pH7.4）继续灌流10min后取下肝脏，剪开肝包膜，将肝细胞悬液过滤清洗后悬浮于含100

7、mL/L新生小牛血清的DMEM培养基中，并用台盼蓝染色法检测细胞活力达90％.将肝细胞随机分成11组，即正常对照组、模型对照组、全方制剂含药血清组、阴性制剂含药血清4组和单味药含药血清4组，每组设6个复孔，以1×105个/cm2接种于96孔及48孔板中，置CO2培养箱37℃培养.细胞培养24h后，弃上清液，模型对照组和各试验组更换为加入CCL410mmol/L的DMEM培养液，正常对照组用DMEM培养基，并在