出口海水网箱养殖鱼类病害调查研究

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1、出口海水网箱养殖鱼类病害调查研究出口海水网箱养殖鱼类病害调查研究　　为了提高海水养殖鱼类品质、规范养殖生产、减少养殖自身污染、保障鱼类食用安全和出口质量，本文作者开展了出口海水网箱养殖鱼类的病害调查研究。对浙江省台州海域8个养殖区域(其中玉环5个、温岭2个、乐清1个)进行周年实地调查，及时取样，实验与分析相结合的方法，通过相关县市水产技术推广站每年提供的数据等获取流行病学资料，按流行病学统计方法进行资料分析和处理。结果显示，海水网箱养殖鱼类细菌性病害仍是危害养殖生产的最常见、影响最大、经济损失最严重的病害。　　　　1　实验对象和方法　　　　1.1实验对象　　以鲈

2、鱼、美国红鱼、黑鲷、真鲷等主要品种为调查实验对象。分4个不同季节对8个养殖区域随机抽样检测分析。　　　　1.2常规检测方法　　肉眼观察：主要观察鱼类外观症状如长短、粗细、体形，体表及鳍条有否破溃、附着物、缺损、充出血、肿块；鳃盖有否肿大，肛门是否红肿等。解剖检查：将鱼置于白搪瓷盘中从排泄孔处解剖，检查各脏器；打开鳃盖，检查鳃部。显微镜检查：体表刮取少量粘液置于载玻片上，加滴蒸馏水，盖上盖玻片制成水封片于显微镜下镜检；用剪刀剪取部分鳃丝做成水封片镜检；剪开肠管，刮取前中后肠壁上的粘液和内容物做成水封片镜检；剪取少量后。肾组织做成水封片镜检。细菌培养纯化和药物敏感试

3、验：在无菌状态下剪取病鳗体组织，接种于选择性细菌培养基上(如糊精品红培养基、RS培养基、AOA培养基)，适当温度下培养并纯化，用于药物敏感试验。　　　　1.3快速检测手段　　　　1.3.1血清学凝集反应在一定的电解质存在下，抗原吸附其相应抗体而发生凝集块的过程。多种凝集技术已应用于鱼类的细菌病诊断。凝集反应的灵敏度虽然低一些，但速度快，几小时即可获得结果，不仅适用于实验室，也可用于养殖场实地诊断。以(Yoshimizupokimura，1985)协同凝集反应技术为例：①配制抗体致敏葡萄球菌(sensitizelstaphylococuil)；②取病鱼肝、肾或病灶

4、组织，加49滴PBS液，匀浆；③经4000r／min离心后，取上清液；④在玻片上加1滴组织上清液，1滴抗体致敏的葡萄球菌悬液，混匀后置于湿盒内反应30－90min；⑤肉眼或低倍显微镜检查结果，凝集反应阳性则表示组织内含有抗体相应的病原。　　　　1.3.2免疫荧光抗体技术采用荧光色素标记免疫球蛋白，抗体与荧光色素经化学偶合后，仍然保持其免疫学反应特性，荧光标记的抗体，能鉴定组织涂片的病原体，不需从病鱼中分离病原。以Rogers1981年鉴别E.ictaluri为例，简述其方法：①从病鱼肝、肾或病灶取一小块组织，在玻片上涂片，晾干，60℃微热固定；②加几滴免抗E.i

5、ctaluri血清于玻片上，于室温5min，最好放置在一避光潮湿的容器内；③用PH7.2磷酸盐缓冲液(PBＳ)冲洗；④加几滴异硫氰酸荧光素标记的羊抗免IgG放置5min；⑤用PBS冲洗、晾干；⑥加1滴封闭液，覆上盖玻片，在荧光显微镜下检查。如在涂片的不同部位，显现苹果绿颜色荧光即表示存在E.ictaluri病原。　　　　1.3.3免疫酶标吸附试验(ELISA)方法与荧光标记抗体诊断法类似，采用酶标记抗体作为示踪抗体。酶联免疫吸附检测方法：多采用13cm8cm的96孔微量酶标板，它可检测鱼体组织内的病原体，亦可检测其血清中相应的抗体水平，以推断鱼体是否感染过病原菌

6、。以Adams等(1990)诊断A.salmonicida为例，简述该方法：①加100μ1抗A.salmonicida血清缓冲液(每毫升缓冲液含5μg免疫球蛋白)到板孔内，塑料薄膜密封后放置过夜；②取出病鱼的肝脏，肾或病灶组织，加8倍磷酸缓冲液匀浆，取上清液；⑧加100μ10.25％酪蛋白封闭液到各孔，置1h；④倒去封闭液用吐温磷酸缓冲液冲洗2次；⑤加100μl组织上清液(含病原菌抗原)到检测孔，设阳性与阴性对照，亦可稀释抗原作抗原定量分析，薄膜密封后置lh；⑥倒去孔内溶液，用PBSTu;1酶标记的抗A.salmonicida免疫球蛋白缓

7、冲液(1：1000稀释在磷酸缓冲液)，薄膜密封后在室温下置1h；⑧倒去孔内溶液，用PBSTu;1显色液置2060min或显示合适的颜色为止，加100μ10.4m01／1NaOH停止显色，比较检测孔和对照孔，记录结果即可。　　　　1.3.4PCR,快速检测技术DNA链扩增反应(PolymeraseChainReaction，PCR)是八十年代末发展起来的一项极具应用潜力技术，已经广泛应用于分子生物学研究以及病原的检测和疾病诊断。其原理是根据已知的病原微生物核酸序列设计出一对特异引物，在含有DNA聚合酶和底物条件下进行DNA体外扩增反应，由于使用了耐热DNA聚

8、合酶，扩增反应可以反复进