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时间:2018-11-21
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1、奥曲肽对人肝癌细胞株MHCC97H的影响论文刘青光,宋涛,孙昊,石磊,张梅【摘要】目的探讨奥曲肽对人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97H的影响及其机制。方法奥曲肽体外作用于生长对数期人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97H,观察生长曲线的变化;应用MTT比色分析法分析细胞的生长抑制作用;透射电镜下观察细胞形态变化。结果奥曲肽在0.2mg/L质量浓度下体外干预MHCC97H细胞使生长受抑;透射电镜下观察呈现凋亡形态改变;在0.05-0.8mg/L质量浓度范围内呈剂量依赖关系抑制人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97
2、H增殖(P0.01),并出现饱和现象。结论奥曲肽对人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97H增殖具有抑制作用,在一定范围内呈剂量依赖关系.freela公司,胎牛血清(FCS)购于杭州四季青公司,甲基噻唑基四唑(MTT)购于Promega公司,CO2孵育箱购于Heraeus公司。1.3细胞培养人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97H培养于含10%(体积分数)灭活胎牛血清的DMEM培养基中,37℃,5%(体积分数)CO2及饱和湿度下CO2孵育箱内培养,2.5g/L胰蛋白酶消化,传代时间3-4d。计数细胞存活率≥95%为对数
3、生长期细胞。1.4细胞生存曲线取对数生长期细胞1×105于50mL培养瓶内,随机设10组,每组复设3瓶,37℃,5%(体积分数)CO2及饱和湿度下CO2孵育箱内培养24h。更换培养基,随机取5组细胞培养瓶内加入奥曲肽至终质量浓度为0.2mg/L,37℃,5%(体积分数)CO2及饱和湿度下CO2孵育箱内继续培养,分别于1-5d各计数一次干预组及阴性对照组的细胞数,取细胞计数平均值,以奥曲肽作用时间为横坐标,细胞计数为纵坐标绘制细胞生长曲线。1.5MTT比色分析法取对数生长期细胞,培养液配成3×105/mL单细胞悬液
4、,每孔200μL接种于96孔板中,随机分为7组,每组复设6孔;另复设6孔加入培养基200μL为调零组。37℃,5%(体积分数)CO2及饱和湿度下培养24h。除调零组外,每组分别加入生理盐水稀释奥曲肽,使各组奥曲肽终质量浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/L,阴性对照组加入等体积生理盐水,轻微吹打,37℃,5%(体积分数)CO2及饱和湿度下培养36h。各孔加5g/L甲基噻唑基四唑(MTT)20μL,培养4h至出现蓝色结晶物。吸弃孔内培养液,每孔加入150μL二甲基亚砜,震荡10min。4
5、90nm波长下酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值(A),计算各浓度下奥曲肽对MHCC97H细胞的抑制率。抑制率=(1-加奥曲肽组平均吸光度值/加无菌生理盐水组平均吸光度值)×100%1.6透射电镜扫描37℃,5%(体积分数)CO2及饱和湿度下,对数生长期细胞3×105于50mL细胞培养瓶内培养24h,阳性干预组加入奥曲肽至终质量浓度为0.2mg/L;阴性对照组加入等体积生理盐水,继续培养48h。胰蛋白酶消化细胞,置于EP管中,离心2000×g,10min,弃上清,加入4℃预冷的2.5%(体积分数)戊二醛固定2h,
6、PBS清洗,再用1%(10g/L)锇酸固定30min,PBS洗,梯度乙醇脱水,环氧树脂包埋,超薄切片机切片,醋酸铀和枸橼酸铅双染色,透射电子显微镜下观察并摄影。1.7统计学处理实验数据以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用方差分析,细胞抑制率与奥曲肽质量浓度间关系检验采用相关分析。SPSS10.0统计学处理,以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1Oct对肝癌细胞生长曲线的影响处于对数生长期的人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97H在未给予奥曲肽干预时,细胞分裂增殖旺盛;给予奥曲肽干预(0.2mg/L)时,细
7、胞分裂增殖在干预后第3天开始出现明显减缓,第5天甚至出现“负增长”,提示在0.2mg/L质量浓度时,奥曲肽不仅抑制MHCC97H细胞的增殖,而且有细胞死亡出现(图1)。2.2奥曲肽对肝癌细胞抑制率的影响细胞毒性实验可见随奥曲肽质量浓度在0.05-0.8mg/L范围增加时,细胞抑制率逐步由10.97%提升至45.16%,细胞抑制率与奥曲肽质量浓度明显相关(r=0.86,P0.01);同时当奥曲肽质量浓度在0.05-0.4mg/L范围时,细胞抑制率随奥曲肽质量浓度的增加快速提升,而质量浓度在0.4-0.8mg/L范
8、围内时,细胞抑制率随奥曲肽质量浓度增加的趋势明显减缓;相邻的奥曲肽质量浓度下细胞抑制率两两对比可见当奥曲肽质量浓度在0.05-0.4mg/L范围内时,相邻组间差异具有统计学意义(P0.05),而在0.4-0.8mg/L范围内时,相邻组间差异不具有统计学意义(P0.05,表1),出现饱和现象。表1不同浓度奥曲肽作用MHCC97H细胞的抑制率(略)2.3奥曲肽对肝癌细胞超微
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