奥曲肽对人肝癌细胞株mhcc97h的影响

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1、奥曲肽对人肝癌细胞株MHCC97H的影响作者：刘青光，宋涛，孙昊，石磊，张梅【摘要】目的探讨奥曲肽对人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97H的影响及其机制。方法奥曲肽体外作用于生长对数期人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97H，观察生长曲线的变化；应用MTT比色分析法分析细胞的生长抑制作用；透射电镜下观察细胞形态变化。结果奥曲肽在0.2mg/L质量浓度下体外干预MHCC97H细胞使生长受抑；透射电镜下观察呈现凋亡形态改变；在0.05-0.8mg/L质量浓度范围内呈剂量依赖关系抑制人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97H增殖(P<0.

2、01)，并出现饱和现象。结论奥曲肽对人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97H增殖具有抑制作用，在一定范围内呈剂量依赖关系，其机制与诱导肿瘤细胞凋亡有关。【关键词】原发性肝细胞肝癌；奥曲肽；增殖；凋亡奥曲肽(Octreotide,Oct)为人工合成的生长抑素类似物，与天然的生长抑素相比，具有半衰期长、作用强大、临床应用方便的特点。近年来，Oct对肿瘤的抑制作用受到越来越多的关注。临床上应用Oct治疗神经内分泌性肿瘤已取得了令人满意的效果，而且许多研究表明Oct也可以抑制大肠癌、乳腺癌、甲状腺癌等实体肿瘤的生长转移，并认为该抑制作用与Oct诱

3、导肿瘤细胞凋亡有关。但是，Oct抑制原发性肝癌的研究较少，本实验通过体外实验探讨Oct对人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97H是否存在抑制作用及可能机制，为Oct临床治疗肝癌复发转移提供理论依据。　　1材料与方法　　1.1细胞株　　人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97H购自上海中山医院肿瘤研究所。　　1.2试剂和主要仪器　　生长抑素类似物奥曲肽(商品名：善宁)由瑞士诺华制药有限公司惠赠；DMEM培养基购于Sigma公司，胎牛血清(FCS)购于杭州四季青公司，甲基噻唑基四唑(MTT)购于Promega公司，CO2孵育箱购于Heraeus公

4、司。　　1.3细胞培养　　人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97H培养于含10%(体积分数)灭活胎牛血清的DMEM培养基中，37℃，5%(体积分数)CO2及饱和湿度下CO2孵育箱内培养，2.5g/L胰蛋白酶消化，传代时间3-4d。计数细胞存活率≥95%为对数生长期细胞。　　1.4细胞生存曲线　　取对数生长期细胞1×105于50mL培养瓶内，随机设10组，每组复设3瓶，37℃，5%(体积分数)CO2及饱和湿度下CO2孵育箱内培养24h。更换培养基，随机取5组细胞培养瓶内加入奥曲肽至终质量浓度为0.2mg/L，37℃，5%(体积分数)CO2及

5、饱和湿度下CO2孵育箱内继续培养，分别于1-5d各计数一次干预组及阴性对照组的细胞数，取细胞计数平均值，以奥曲肽作用时间为横坐标，细胞计数为纵坐标绘制细胞生长曲线。　　1.5MTT比色分析法　　取对数生长期细胞，培养液配成3×105/mL单细胞悬液，每孔200μL接种于96孔板中，随机分为7组，每组复设6孔；另复设6孔加入培养基200μL为调零组。37℃，5%(体积分数)CO2及饱和湿度下培养24h。除调零组外，每组分别加入生理盐水稀释奥曲肽，使各组奥曲肽终质量浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/L，阴性对照

6、组加入等体积生理盐水，轻微吹打，37℃，5%(体积分数)CO2及饱和湿度下培养36h。各孔加5g/L甲基噻唑基四唑(MTT)20μL，培养4h至出现蓝色结晶物。吸弃孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，震荡10min。490nm波长下酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值(A)，计算各浓度下奥曲肽对MHCC97H细胞的抑制率。抑制率=(1-加奥曲肽组平均吸光度值/加无菌生理盐水组平均吸光度值)×100%　　1.6透射电镜扫描　　37℃，5%(体积分数)CO2及饱和湿度下，对数生长期细胞3×105于50mL细胞培养瓶内培养24h，阳性干预

7、组加入奥曲肽至终质量浓度为0.2mg/L；阴性对照组加入等体积生理盐水，继续培养48h。胰蛋白酶消化细胞，置于EP管中，离心2000×g，10min，弃上清，加入4℃预冷的2.5%(体积分数)戊二醛固定2h，PBS清洗，再用1%(10g/L)锇酸固定30min，PBS洗，梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋，超薄切片机切片，醋酸铀和枸橼酸铅双染色，透射电子显微镜下观察并摄影。　　1.7统计学处理　　实验数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用方差分析，细胞抑制率与奥曲肽质量浓度间关系检验采用相关分析。SPSS10.0统计学处理，以P<0

8、.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1Oct对肝癌细胞生长曲线的影响　　处于对数生长期的人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97H在未给予奥曲肽干预时，细胞分裂增殖旺盛；给予奥曲肽干预(0.2mg/L)