自制多聚胺阳离子脂质体转染效率及细胞毒性的评价

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1、自制多聚胺阳离子脂质体转染效率及细胞毒性的评价作者：孙瑞琳，金发光，吴道澄，吴红，刘彬，温德升【关键词】多聚胺阳离子脂质体；制备；转染　　Evaluationoftransfectionefficiencyandcytotoxicityofselfpreparedpolyaminecationicliposome　　【Abstract】AIM:Toevaluatethetransfectionefficiencyandcytotoxicityofpolyaminecationicliposome（PCL）preparedbyourselves.METHODS:PCLinecationicli

2、pidsTCCholandneutralphospholipidDOPEatamolarratioof3∶1ine2000（ascontrol）mediatedbytheplasmidPIRES2EGFPinedbyfluorescencemicroscope.ThesurvivalfractioninedbyMTTtoevaluatethetransfectionefficiencyandcytotoxicityaftertransfection.RESULTS:ThetransfectionefficiencyofPCLpreparedolarratioof3∶1ine2000,butt

3、hecytotoxicityoftheformerine2000.Itisshoisingforgenetransfectionandgenetherapy.　　【Keyinecationicliposome;preparation;transfect　　【摘要】目的：评估制备的多聚胺阳离子脂质体转染哺乳动物细胞的转染效率及细胞毒性.方法：多聚胺阳离子脂质TCChol与中性磷脂DOPE以3∶1摩尔比，制备多聚胺阳离子脂质体，通过转染以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的质粒PIRES2EGFP入HeLa细胞,Hep2细胞，倒置荧光显微镜下检测转染细胞的报告基因表达，通过MTT法，检测细胞存活分数，

4、并以Lipofectamine2000为对照，评价制备阳离子脂质体转染效率及细胞毒性.结果：多聚胺阳离子脂质体转染效率略低于Lipofectamine2000，但细胞毒性较低,为一种相对高效低毒的阳离子脂质体.结论：多聚胺阳离子脂质体为一种相对高效低毒的阳离子脂质体，在基因转染和基因治疗方面具有较广阔的前景.　　【关键词】多聚胺阳离子脂质体；制备；转染　　0引言　　基因治疗能否成功最重要的影响因素是基因转染载体.阳离子脂质体能与目的基因以静电作用相结合，可携带的外源基因容量较大,且不含抗原成分，细胞毒性低，可被机体降解，能多次反复转染，因此成为一种有临床应用潜力的基因转染载体［1］.多聚胺阳

5、离子脂质体(polyaminecationicliposome,PCL)易与核酸形成静电复合物而自由通过亲脂性膜，因此，是阳离子脂质体中效果较好的核酸运载载体［2］.本研究旨在以Invitrogen公司阳离子脂质体Lipofectamine2000为对照，转染带有增强型绿色荧光蛋白EGFP质粒PIRES2EGFP入HeLa细胞或Hep2细胞，通过荧光显微镜观察报告基因的表达，评价PCL的转染效率，通过MTT法检测细胞存活分数，评价自制PCL的细胞毒性.　　1材料和方法　　1.1材料TCChol（Sigma），二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE（Sigma），Lipofectamine2000(Inv

6、itrogen)，质粒PIRES2EGFP，感受态细胞DH5α均由我校免疫教研室杨安钢教授惠赠，质粒微量抽提试剂盒（安徽优晶生物工程有限公司），DMEM培养基(Gibco)，胎牛血清(天津TBD)，24孔培养板（Orange），96孔培养板（Orange），MTT（Amresco）.　　1.2方法　　1.2.1PCL的制备［3-4］TCChol溶于适量氯仿后，分别与DOPE以1∶1，3∶1摩尔比混合，在茄形瓶中振荡摇匀使形成一层薄膜，真空除去有机溶剂，同时加Hepes（pH7.8），水浴超声约5～10min制备PCL，透射电镜检测后4℃保存.　　1.2.2质粒DNA提取与纯化［5］质粒PIR

7、ES2EGFP转化感受态细胞DH5α,37℃,200r/min摇菌过夜，质粒微量抽提试剂盒提取质粒，取少许稀释后，紫外分光光度计，以洗脱液为调零孔，测量A230nm,A260nm，A280nm，以A260nm/A230nm>1.5,1.8≤A260nm/A280nm≤2.0为合格质粒，-20℃保存备用.　　1.2.3体外细胞转染［6-7］转染前1d，胰酶消化HeLa细胞，Hep2细胞并计数，按1~2×1