氨肽酶抑制剂对全反式维甲酸诱导人急性早幼粒白血病细胞株nb4细胞分化作用的影响及其机制的初步探讨

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1、氨肽酶抑制剂对全反式维甲酸诱导人急性早幼粒白血病细胞株NB4细胞分化作用的影响及其机制的初步探讨【摘要】为了研究氨肽酶抑制剂乌苯美司（bestatin）对全反式维甲酸（ATRA）诱导人APL细胞株NB4细胞分化作用的影响及其可能机制，NB4细胞经bestatin和ATRA单用或联合应用处理一定时间后，用光学显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测CD11b表达，四氮唑蓝（NBT）还原实验检测分化细胞功能，RT-PCR法检测c-myc和c-EBPεmRNA表达，yc蛋白表达。结果显示：NB4细胞经100μg/mlbestatin和10

2、nmol/LATRA联合处理72小时后，其分化的形态更明显；100μg/mlbestatin与不同浓度ATRA联合处理72小时，能增强NB4细胞的NBT还原能力，与单用相应浓度ATRA组相比，差异显著（P<0.01）；从48-96小时，100μg/mlbestatin能增强10nmol/LATRA诱导NB4细胞的NBT还原能力，且呈时间依赖性，与相应时间点ATRA组相比，差异明显（P<0.01）；与单用10nmol/LATRA组相比，ATRA（10mmol/L)和bestatin（100μg/ml）联用处理72小时

3、，NB4细胞CD11b阳性表达率明显增加（P<0.01）；与单用10nmol/LATRA组相比，联用100μg/mlbestatin处理4小时后，NB4细胞c-mycmRNA表达的降低更明显（P<0.05）；50、75、100μg/mlbestatin与10nmol/LATRA联合处理8小时后，NB4细胞c-Myc蛋白表达水平明显降低，与单用ATRA组相比差异显著（P<0.05）；药物联用各组NB4细胞c-Myc蛋白表达水平与NBT还原能力之间呈负相关（r=-0.940，p=0.017）；与100μg/mlb

4、estatin联用不能增强10nmol/LATRA上调c-EBPεmRNA的表达；50、75、100μg/mlbestatin单独处理对NB4细胞的分化无影响。结论：氨肽酶抑制剂bestatin能够增强ATRA对NB4细胞的诱导分化作用，这可能与bestatin协同ATRA下调c-myc的表达有关。【关键词】细胞株　　EffectofAminopeptidaseInhibitoronDifferentiationInductionActivityofAll-transRetinoicAcidinHumanAcutePromye

5、locyticLeukemiaNB4CellsandItsMechanism　　AbstractThisstudyinopeptidaseinhibitor，bestatin，canpotentiateall-transretinoicacid(ATRA)-inducingdifferentiationinNB4cells，andtoexploreitsmechanism.TheNB4cellsorphologicalchangesofNB4cellsicroscopy，theCD11bexpressioneasuredbyf

6、loetry，thefunctionofdefferentiationcells(NBT)reductionassay，themRNAexpressionsofc-mycandc-EBPεinNB4cellsinedbyI1640细胞培养液将其稀释为相应工作浓度。NBT为BBI公司产品，以PBS配成0.1%溶液，过滤除菌后4℃避光保存，使用前1周内配制。RPMI1640为Gibco公司产品。胎牛血清为JRH公司产品。CD11b-FITC标记单克隆抗体为Teotech公司产品。CD13-PE标记单克隆抗体为BectonDicki

7、nson公司产品。TRIzoL试剂为Gibco公司产品，M-MLV逆转录酶和TaqDNA合成酶为Promega公司产品。鼠抗人c-Myc单克隆抗体（c-33）及羊抗人β-Actin多克隆抗体（I-19）均为SantaCruz公司产品，使用时以TBST液分别按1∶500和1∶1000稀释。ECL显色液为SantaCruz公司产品。　　细胞培养及药物处理　　人APL细胞株NB4细胞（浙江大学肿瘤研究所惠赠）及人髓细胞白血病细胞株HL-60细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液中，置37℃、5%CO2培养箱中培养，2

8、-3天传代1次。实验时取对数生长期的细胞，调整细胞密度为7×104/ml，以不同浓度ATRA和bestatin单独或联合处理，于不同时间收集细胞进行实验。　　细胞形态学观察　　取空白对照组及药物处理各组细胞悬液，离心，制备涂片，瑞氏-姬姆萨染色，用光学显微镜（Leica，40