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时间:2018-11-20
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1、小麦总RNA的小量快速提取小麦总RNA的小量快速提取 摘要:以小麦幼苗的叶、茎和根组织为材料,采用CTAB法和尿素法分别提取其总RNA。结果表明,CTAB法提取的总RNA经电泳检测,28SrRNA和18SrRNA带型完整;A260/A280的比值接近2,纯.L.度较高;将提取的总RNA反转录合成cDNA,可用于RT-PCR分析。尿素法提取叶和茎组织的总RNA质量较好,但提取根组织的效果较差。说明CTAB法较适合小麦幼苗各组织总RNA的提取。同时,两种方法提取过程中均不使用液氮,可节约试验成本。 关键词:小麦;总RNA;提
2、取 高质量RNA的提取是分子生物学研究的重要一环,直接影响cDNA文库的构建、基因克隆以及表达分析等。小麦是重要的农作物,其RNA提取方法较多[1-5]。尽管这些方法提取的RNA质量较好,但都要使用液氮,提高了试验成本。本研究采用CTAB和尿素法分别提取小麦幼苗的根、茎和叶组织的总RNA,为小麦总RNA的提取提供了一条新途径。 1材料与方法 1.1植物材料 小麦杂交品种郑麦9023购于荆州市农资大市场,播种于温室,在苗期分别取根、茎和叶组织用于RNA的提取。 1.2方法 1.2.1RNA提取液成分CTA
3、B法RNA提取液成分:20g/LCTAB,20g/LPVP,100mmol/LTris-HCl(pH值8.0),25mmol/LNa2EDTA(pH值8.0),2.0mol/LNaCl,混匀灭菌,用前每100mL提取液加入2mL2-巯基乙醇。 尿素法RNA提取液成分:7mol/L尿素,50mmol/LTris-HCl(pH值8.0),10mmol/LNa2EDTA(pH值8.0),3.5mol/LNaCl,1g/LSDS。 1.2.2RNase灭活离心管和移液器吸头用1mL/LDEPC水浸泡24h;研钵等用少量的无水乙
4、醇灼烧,然后用锡箔纸包装;Tris试剂用灭菌的1mL/LDEPC水配制,其他试剂均用未灭菌的1mL/LDEPC水配制;最后,将以上所有试剂或物品高压灭菌40min。 1.2.3尿素法提取RNA步骤①取0.2g材料,加入研钵中,加入2mL提取液,迅速充分研磨;②快速分装到两支1.5mL的离心管中,于4℃、12000r/min离心15min;③取上清液,加1/3体积的3mol/LNaAc(pH值5.3),1/5体积的氯仿/异戊醇(24∶1),混匀后冰浴20min;④于4℃、12000r/min离心15min;⑤取上清液加入等
5、体积冰浴冷却的异丙醇,冰浴10min;⑥于4℃、5000r/min离心10min;⑦沉淀溶于5mL含有1g/LSDS的TE缓冲液中,加入8mol/LLiCl至终浓度2.5mol/L,冰浴3h;⑧于4℃、12000r/min离心10min;⑨70%(V/V)乙醇洗涤沉淀两次,空气干燥后溶于DEPC处理水中,保存于-70℃冰箱中备用。 1.2.4CTAB法提取RNA步骤①将提取液置于65℃水浴锅中温浴30min,将研钵放在烘箱中低温烘热;②取0.2g材料于研钵中,加入2mL提取液,迅速充分研磨,然后快速分装到两个1.5mL离
6、心管中,轻轻混匀,置于65℃水浴锅中10min;③加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀后在4℃,12000r/min条件下离心10min,吸取上清液;④重复上述步骤,并在合并的上清液中加入1/4体积的8mol/LLiCl溶液并混匀,4℃过夜;⑤4℃10000r/min离心20min,弃上清液;⑥加入50μL的灭菌DEPC水溶解RNA,再加入1/10体积的3mol/LNaAc和2倍体积的无水乙醇,于-70℃放置30min;⑦于4℃、 12000r/min离心20min,弃上清液,用70%(V/V)的乙醇清洗沉淀,吹干后加入
7、30μL的灭菌DEPC水溶解,保存于-20℃冰箱中备用。 1.2.5总RNA完整性检测 1)琼脂糖凝胶电泳检测:电泳槽用1mL/LDEPC水浸泡24h,用1MOPS作为电泳缓冲液。取2μLRNA溶液于10g/L琼脂糖凝胶电泳检测,电压为90V。 2)紫外分光光度计检测:取4μLRNA溶液,用分光光度计测定A260和A280的值。每种组织取3份RNA溶液样品,求平均值。 3)RT-PCR分析:使用PromegacDNA第一链合成试剂盒,合成cDNA第一链。反应完成后,将合成产物稀释5倍,取1μ
8、L用于RT-PCR的模板cDNA。根据小麦actin基因(AB181991)设计1对引物,左引物为:5′CAAGGCGGAGTACGATGAGT3′,右引物为:5′TTGTGCCAAAAGGAAAAGCT3′。RT-PCR反应体系为25μL:即10T
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