cgrp和ngf对全脑缺血再灌注大鼠脑组织pkb表达的调节作用论文

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1、CGRP和NGF对全脑缺血再灌注大鼠脑组织PKB表达的调节作用论文【摘要】研究大鼠脑缺血再灌注后蛋白激酶B（proteinkinaseB,PKB）的表达，探讨降钙素基因相关肽（CGRP）和神经生长因子（NGF）对脑组织缺血再灌注的保护作用及机制。方法：根据Nagasapusafterregionalcerebralischemiaandreperfusioninrats,exploretheprotectiveeffectsandmechanismofcalcitoninandgenerelatedpeptide(CGRP)andnervegroodel

2、ofregionalcerebralischemiaandreperfusioninducedbymiddlecerebralarteryoccluded(MCAO)inratsode．TheexpressionofPKBinhippocampusandcortexicroscope,SABCimmunohistochemicalmethodandanalyzedbymicroimagesystem.Results：TheexpressionofPKBinhippocampusandcortexiaandreperfusion(P0.05)．Ｃompare

3、dmunoreactionpositivecellsinCGRPorNGFgroupicneurons,andtheymaycooperatepus;neuronischemia脑缺血导致神经元坏死变性、迟发性神经元死亡和（或）凋亡，其机制十分复杂，至今尚不完全清楚。降钙素基因相关肽（calcitoningenerelatedpeptide,CGRP）是于1982年第一个利用基因重组技术发现的活性多肽，由37个氨基酸组成，广泛存在于神经组织，具有改善脑血流及神经保护作用1。神经生长因子（nervegrog/kg)腹腔注射麻醉。将大鼠固定于手术操作台,作颈

4、前正中切口,游离出右侧颈总动脉、颈内、外动脉后结扎颈总动脉和颈外动脉起始部,于颈总动脉分叉部下方剪一小口,将一预先烧成圆头的尼龙线插入颈内动脉,向上至遇到轻微阻力为止(一般线的头端已达大脑中动脉起始部)以栓塞血管。由颈总动脉分叉部起始,其插入的深度平均为(20.5±0.5)mm。栓塞90min后回抽出线栓约10mm,恢复再灌注。其它各组分别向颈动脉内注入NGF（500U/ml，0.5ml）、CGRP（2μg/ml，0.5ml）、CGRP（2μg/ml，0.5ml）和NGF（500U/ml，0.5ml）30min注射完。此后分别于24h后处死取材。手术过程中

5、常规检测肛温,使肛温保持在(37.0±0.5)℃。大鼠术毕清醒后,观察其行为学变化,按ZeaLonga评分标准将动物的行为变化分为5级:0级,行为无明显变化;1级,左前肢屈曲,左后肢伸展;2级,有左侧追尾现象;3级,行走困难,摇摆不定;4级,意识不清。将1、2、3级动物定为模型成功大鼠,0、4级弃去不用。假手术组仅夹闭右侧颈总、颈外动脉以中断血流90min,术后未见行为异常。用4%多聚甲醛灌注，常规冰冻切片。1.2电镜实验结束后,将各组大鼠断头处死,迅速取出海马,按电镜样品取材要求,3%戊二醛、1%锇酸双固定,常规包埋,光镜选区,制备超薄切片,铀、铅双染,

6、100CXⅡ型透射电镜观察。1.3免疫组织化学染色脑的冠状切面冰冻切片，片厚12μm。常规HE染色,光镜下观察假手术组及缺血组的组织学变化，采用免疫组化SABC法检测大脑皮质及海马PKB的表达。多克隆PKB抗体（兔抗大鼠，SantaCruz,中国Boster公司代理）以1：100稀释，按SABC试剂盒（Boster公司）说明操作。阳性对照实验磷酸验缓冲液代替一抗进行免疫组化染色。用图像分析仪取每张切片每个部位各测5个相同单位面积的平均灰度值。1.4统计学方法数据采用t检验并进行统计学处理。2结果2.1电镜假手术组大鼠海马神经元核比较大、呈圆形或椭圆形,核膜

7、清晰、完整,核质电子密度低,常染色质多,呈细颗粒状,分布均匀,核仁呈网状,居中;胞质内细胞器丰富,线粒体呈椭圆形或杆状,粗面内质网(RER)散在分布,结构清晰。缺血再灌注组可见核染色较浅,核仁增大且致密,胞质水肿,线粒体肿胀、嵴断裂,基质电子密度增高,粗面内质网脱颗粒;轴突内线粒体空泡样变,髓鞘分层、散乱。神经元胞体水肿,核膜断裂、模糊不清或崩解,异染色质增多,核仁浓密,胞质内线粒体外膜模糊、不连续,嵴断裂、溶解、消失呈空泡化,内质网水肿、扩张、脱颗粒。有的神经元部分核膜清晰,核周隙增宽,部分核膜溶解,染色质呈团块状凝集,核仁碎裂;胞质内细胞器明显减少而致

8、电子密度变低,残存的线粒体崩解呈空泡状,但尚可辨认;内质网减少,神