冻存前后骨髓间充质干细胞的生物学特性和支持造血的研究

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1、冻存前后骨髓间充质干细胞的生物学特性和支持造血的研究作者：赵智刚，唐晓琼，黎纬明，游泳，邹萍【摘要】为了了解冻存复苏过程对骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcell，MSC)生物学特性和支持造血能力的影响，采用常规方法分离培养骨髓MSC，将传代后的细胞用含10％二甲亚砜、40％胎牛血清的IMDM细胞冻存液保存在-196℃液氮中，观察短期（4周）和中期（9-15月）复苏后MSC的活性、免疫表型、多向分化能力和支持造血的能力，并同冻存前的MSC进行比较。结果表明：中短期冻存后的MSC的细胞活性分别

2、为(90士3.75)％和(93士2.51)％；冻存后细胞的增殖能力、免疫表型、体外分化为脂肪和骨细胞的能力、支持集落（CFU-GM，CFU-E，CFU-GEMM）的生长作用和冻存前MSC相似。结论：骨髓MSC在液氮中短期和中期保存后，细胞活性略有下降，但是并不影响MSC的增殖、分化和支持造血能力。【关键词】支持造血　　BiologicalCharacteristicsandAbilityofSupportingHematopoiesisofBoneMarroalStemCellsPre-andPost-Cr

3、yop-reservation　　AbstractThisstudyedtoobservethebiologicalcharacteristicsofcryopreservedbonemarroesenchymalstemcell(MSC)andtoexaminethEirabilitiestosupportinvitrohematopoiesis.Bonemarro)and9-15months(mediumterm)ascryoprotectant.Theviability，proliferation，i

4、mmunophenotype，invitrodifferentiationandabilityofsupportinghematopoiesisofthaonthsrespectively.Homunophenotype，abilitiesofproliferationandsupportingcolonyformingofCFU-GM，CFU-EandCFU-GEMM.Itisconcludedthatbonemarro(4edium-term(9-15months)atopoiesissupport.　

5、　Keyesenchymalstemcell；hematopoiesissupport　　间充质干细胞（mesenchymalstemcell，MSC）具有多向分化和支持造血的能力，而且来源广泛，容易在体外培养和扩增，目前已经应用于临床并显示了良好的治疗效果［1-4］。将培养后的MSC冻存，在患者需要MSC治疗时给予输注，具有很好的临床应用前景。但是，冻存是否会影响MSC的生物学特征，我们尚不清楚。因此，本研究将骨髓来源的MSC冻存于-196℃液氮中，观察中期和短期冻存后MSC的增殖、分化和支持造血的能力并

6、同冻存前的MSC进行比较，为进一步在临床中的应用提供详尽的实验依据。　　材料和方法　　试剂　　IMDM、DMEM、DF12、MCDB培养液、胎牛血清、马血清和甲基纤维素均为Gibco公司产品。鼠抗人CD11b、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105和HLA-DR抗体购自PharMingen公司;rh-SCF、GM-CSF、EPO、IL-3购自Peprotech公司;胰酶、EDTA、全反式维甲酸、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤（IBMX）和二甲亚砜（DMSO）购自Sigma公司。　　MSC

7、的分离和培养　　骨髓来自8例健康志愿者（年龄18-34岁，平均29岁）。髂后上棘抽取骨髓，用淋巴细胞分离液（密度1.077）400×g离心20分钟，取白环以上细胞部分，计数后接种于含40%MCDB、2%FCS的DF12培养液中，置37℃、5%CO2培养箱中培养，24小时后换液，去除未贴壁细胞。当细胞达到70%融合时，常规消化传代。　　MSC的冻存和复苏　　将1×106细胞加入含10％DMSO和40%FCS的IMDM中，总体积1.8ml。先置于-80℃冰箱中，第二天转入-196℃中冻存。将中期9-15个月（平

8、均13个月）和短期（4周）冻存的MSC置于37℃水浴中快速复温，冻融后加入8mlIMDM混匀后离心，然后再用IMDM洗涤1次，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。第2天，更换新鲜培养液。　　细胞活性和增殖能力测定　　应用台盼蓝拒染回收率（TBR）试验检测复苏细胞的活性，TBR(%)＝冻存后活细胞计数/冻存前活细胞计数×台盼蓝拒染率×100％。将冻存前后的MSC接种在24孔板中（5×103细胞/孔），置37℃、5%