改进的核移植方法完成小鼠卵丘细胞重组胚的早期发育

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1、改进的核移植方法完成小鼠卵丘细胞重组胚的早期发育作者：沈新明1,2；乔贵林1；江培洲1；李欣1；黄华1；姚开泰1　　(1南方医科大学肿瘤研究所，广东  广州  510515，2上海市东方肝胆外科医院，上海  200438)摘要：目的  建立一种快速、简便、有效且损伤小的核移植方法，研究来源于小鼠体细胞重组胚的早期发育。方法  用尖锐的去核针在MⅡ期卵母细胞透明带上切开一个25mm左右的小口，首先将第一极体挑出，再轻轻地挤压和负压吸引卵母细胞，去除包含有MⅡ期染色体-纺锤体复合体的最少量细胞质。随后，将直径为10~12m

2、m的C57BL/6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下，构建供体核-卵母细胞复合体。用电融合的方法诱导复合体融合，并对重组胚激活。体外培养72h，对重组胚发育到2细胞、4~8细胞和桑椹胚期等各阶段进行观察和计数。结果  完成一个MⅡ期卵母细胞去核的平均时间为15s；Hoechst33342染色证明可以完全去除MⅡ期卵母细胞细胞核；去核成功率为95.5%，注核成功率为76.7%，供体核-卵母细胞复合体融合和重组胚原核形成率分别为68.2%和62.2%；重组胚体外培养72h内发育到2细胞、4~8细胞和桑椹胚期的比率分

3、别为57.5%、39.1%和27.6%；用2个微卫星位点D7Mit22和D4Mit204引物，扩增不同发育阶段重组胚的DNA片段，表明重组胚来源于供体卵丘细胞。结论  应用改进的核移植方法，不仅可以有效地去除卵母细胞细胞核，去核成功率高，而且操作简便，去核迅速，对卵母细胞损伤小，是研究小鼠体细胞核移植的一种简便可行的新方法。关键词：细胞核/移植；电融合；卵母细胞；重组胚中图分类号：R329.25  文献标识码：A  文章编号：1000-2588(2005)06-0613-06Amodifiedmethodofnucle

4、artransferforinvestigatingearlydevelopmentofmouseembryosreconstructedwithcumuluscellnucleiSHENXin-ming1,2；QIAOGui-lin1；JIANGPei-zhou1；LIXin1；HUANGHua1；YAOKai-tai11InstituteofCancerResearch,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2EasternHepatobiliaryHosp

5、ital,Shanghai200438,ChinaAbstract:ObjectiveToestablishafast,simple,efficientandminimallyinvasivemethodfornucleartransfer(NT)tostudytheearlydevelopmentofmouseembryosreconstructedwithcumuluscellnucleiinvitro.MethodsWithasharp-tippedenucleationneedle,anincisionappr

6、oximately25mminlengthwasmadeinthezonapellucidaofaratoocyte,throughwhichthefirstpolarbodywasremovedandthemetaphaseⅡchromosome-spindlecomplexwasgentlyaspiratedalongwithaminimalvolumeofthecytoplasmbyslightlypressingandvacuumaspirationoftheoocyte.Acumuluscellnucleif

7、romC57BL/6jmouse,10-12mmindiameter,wasinsertedintotheperivitellinespaceoftheenucleatedoocyte.Thefusionofthedonor-recipientpairwasinducedbyelectrofusionandnuclearformationwasobserved.Thedevelopmentof2-cell,4-to8-cellandmorula-stageembryoswasobservedaftera72-hourc

8、ultureofthereconstructedoocytesinvitro.ResultsThemodifiedNTmethodenabledone-stepremovalofthewholenucleusfromtheoocytewithconfirmedreliabilityofcompletenuclearremovalb