悦肝胶囊对四氯化碳损伤原代培养大鼠肝细胞的保护作用论文

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1、悦肝胶囊对四氯化碳损伤原代培养大鼠肝细胞的保护作用论文蔡英兰，金政，朴丽花，李相伍，金美善【关键词】悦肝胶囊；,.freelaryCulturedRatHepatocytesAbstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectsofYueganCapsuleonCCl4intoxicatedprimaryculturedrathepatocytes.MethodsHepatocytesinjurymodelsountofhepaticglycogenountofhepaticglycogen,andrestraintheactivityofACPase,andcou

2、ldimprovethechangesofrathepatocytesstructure.ConclusionYuegancapsulehasprotectiveeffectsonCCl4inducedinjuryofprimaryculturedrathepatocytes.Keyl）；CCl4：北京化学试剂厂产品；东宝肝泰片：中国通化东宝药业股份有限公司产品；新生小牛血清：杭州四季青生物工程公司产品；RPMI1640培养基：GIBCO公司产品；胰蛋白酶：DIFCO公司产品；胶原酶：SIGMA化学公司产品。1.3仪器SC35型倒置显微镜：日本OLYMPUS产品；VANOX型万能显微镜：日本O

3、LYMPUS产品；S3500N型扫描电镜：日本HITACHI公司产品；TD2000型图像分析仪：北京天地百年科技有限责任公司产品。2方法2.1原代单层乳鼠肝细胞培养方法采用姜玉顺等［3］建立的方法培养至3~4d后用于实验。2.2CCl4诱发培养肝细胞损伤病理模型的制备用RPMI1640培养液配成3，5，7mol/L浓度经筛选，选用5mol/L浓度为本实验可逆性肝细胞损伤模型。2.3分组培养大鼠肝细胞3~4d，取生长良好的培养瓶40瓶分为4组。正常对照组每隔3天更换培养基；模型对照组加入5mol/LCCl4；药物对照组加入5mol/LCCl4+0.24mg/L东宝肝泰；实验组加入5mol/LCC

4、l4+1.5mg/L悦肝胶囊。作用24h后，模型对照组换接种培养基；药物对照组换加有0.24mg/L东宝肝泰的培养基；实验组换加有1.5mg/L悦肝胶囊的培养基继续培养。2.4细胞化学观察取生长盖玻片，显示SDH、ACPase、G6Pase和糖原。SDH显示采用亚铁氰化甲法；ACPase显示采用Gomori法；G6Pase显示采用PUS万能显微镜观察拍片并利用病理显微分析系统进行定量分析（每组随机选5张盖玻片，每张盖玻片再随机选3个视野，测定每个视野颗粒面积百分比）。2.5扫描电镜观察取生长良好的培养瓶，弃去培养液，经PBS冲洗，4%戊二醛固定4h，然后再冲洗3次，2%锇酸液固定3h，常规冲洗

5、、脱水、乙酸异戊酯置换、HCP2临界点干燥、离子溅射镀金膜，扫描电镜观察。2.6数据处理应用SPSS10.0统计软件进行方差分析。3结果3.1细胞化学观察SDH：模型对照组SDH反应颗粒比正常对照组明显减少，染色浅；实验组SDH活性明显增强、染色深。ACPase：与正常对照组相比，模型对照组ACPase活性明显增强，而实验组则有所下降。G6Pase：模型对照组G6Pase反应颗粒比正常对照组明显减少，染色浅；实验组G6Pase活性明显增强、染色深。糖原：与正常对照组相比，模型对照组糖原含量减少，实验组糖原含量接近正常。结果见表1。表1各组乳鼠肝细胞细胞化学染色酶颗粒定量分析结果（略）与模型对照

6、组比较，*P0.001；与正常对照组比较，#P0.053.2扫描电镜观察正常对照组原代培养大鼠肝细胞表面微绒毛密集，细长，有分枝并相互交织。模型对照组微绒毛明显矮小、稀疏，细胞存活率降低。实验组肝细胞表面微绒毛与模型对照组相比明显增多、变高，接近正常对照组，而且细胞存活率也明显高于模型对照组。4讨论一般认为，CCl4进入机体后，被肝脏细胞色素P450激活，经肝微粒体NADPH依赖的电子传递系统代谢为三氯甲基自由基（CCl3）和三氯甲基过氧自由基（OOCCl3），这两种自由基可掺入到微粒体膜的磷脂部分，启动脂质过氧化，引起肝细胞的各种变化导致肝损伤［4］。SDH位于线粒体内膜与呼吸链形成复合体，

7、由于过氧化脂质的损伤作用，引起上述复合体的改变或破坏，进而使SDH活性下降，由于CCl4作用产生的过氧化脂质及脂质过氧化物与蛋白质分离产生溶酶体，因此，溶酶体数目增加，溶酶体的标志酶ACPase活性增强。CCl4引起线粒体结构的不完整和破坏，自然影响有氧代谢合成ATP的主要供给途径，此时，肝细胞不得不大量分解糖原进行无氧代谢合成ATP，导致糖原减少，而悦肝胶囊能明显改善上述改变。我们的前期实验也表