p38 mapk在嗜酸性粒细胞活化支气管上皮细胞释放mcp论文

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1、p38MAPK在嗜酸性粒细胞活化支气管上皮细胞释放MCP论文王成彬，童红莉，田亚平,汪德清，黄振国，叶伟基，李洛谊，林伟基【关键词】上皮细胞Regulatoryroleofp38MAPKforMCP1releasefromactivatedbronchialepithelialcellsbyeosinophils【Abstract】AIM:Toinvestigatethereleaseofmonocytechemoattractantprotein（MCP）1fromthecocultureofhumanbr

2、onchialepithelialcellsandeosinophilsandtherelatedmechanisms.METHODS:MCP1inculturesupernatantinedbyCytometricBeadArray(CBA)KitinfloetrytopareMCP1releaseinbronchialepithelialcellsandeosinophilsculturedaloneortogether,andinvestigatetheinhibitiveeffectofSB20358

3、0,aselectiveinhibitorofp38MAPK,onMCP1release.Thereversetranscriptasepolymerasechainreaction(RTPCR)matoryreaction.【Keyonocytechemoattractantprotein1;p38MAPK【摘要】目的：探讨支气管上皮细胞与嗜酸性粒细胞联合培养过程中炎性介质的释放及其机制.方法：应用流式细胞微珠实验（CBA）方法定量比较嗜酸性粒细胞、支气管上皮细胞及其联合培养上清液中单核细胞趋化蛋白（MCP

4、）1的释放以及p38MAPK抑制剂SB203580干预的影响；用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）分析联合培养过程中嗜酸性粒细胞对支气管上皮细胞MCP1基因表达的活化及SB203580对MCP1表达的抑制作用.结果：经嗜酸性粒细胞活化后，支气管上皮细胞中MCP1基因表达明显上调；嗜酸性粒细胞和支气管上皮细胞联合培养上清液中MCP1蛋白质释放显著增加［(1266±127)ng/Lvs(134±25)ng/L,P0.001］；多聚甲醛固定后的嗜酸性粒细胞不能释放MCP1.freelLPercoll原液(密度1.13

5、0,瑞典Amersham公司产品)，15mL1.5mol/LNaCl和47.1mL去离子水；抗CD16抗体磁珠和细胞磁性分离系统（MACS）购自德国MiltenyiBiotec公司；p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）抑制剂SB203580购自美国Calbiochem公司；DMEM/F12，RPMI1640细胞培养液购自美国GibcoInvitrogen公司；RNA抽提试剂TRIReagent购自美国MolecularResearchCenter公司；人细胞趋化因子CBA测定试剂盒购自美国BD公司；第一

6、条链cDNA合成试剂盒购自瑞典Amersham公司；MCP1和βactinPCR扩增引物为美国Invitrogen公司产品；流式细胞仪（FACSCalibur）为美国BD公司产品；DNA热循环仪（PTC200）为美国MJ公司；新鲜人全血由香港红十字会输血服务中心提供.1.2方法1.2.1嗜酸性粒细胞分离新鲜人全血中血细胞通过密度为1.082kg/LPercoll溶液离心分层，去除淋巴细胞层后用冰浴去离子水裂解红细胞，所剩嗜中性、酸性粒细胞与抗CD16抗体磁珠反应使细胞表面带有CD16蛋白质的嗜中性粒细胞与磁珠

7、结合.当嗜中性、酸性粒细胞混悬液通过磁性分离柱时，由于磁性作用使结合在磁珠上的嗜中性粒细胞吸附于分离柱上，而表面不表达CD16的嗜酸性粒细胞则可以顺利通过分离柱.分离后的嗜酸性粒细胞用伊红染色鉴定其纯度，计数并调整到适当浓度，再悬浮于含100mL/L小牛血清的RPMI1640细胞培养液中待用.1.2.2嗜酸性粒细胞固定分离后的嗜酸性粒细胞用10g/L多聚甲醛在室温中固定3h，再用含20mL/L小牛血清的PBS清洗3遍，计数并调整到适当浓度，再悬浮于含100mL/L小牛血清的RPMI1640细胞培养液中待用.1

8、.2.3细胞培养人支气管上皮细胞系（BEAS2B，美国ATCC公司购买）置含100mL/L小牛血清的DMEM/F12细胞培养液中，37℃,50mL/LCO2孵育.1.2.4MCP1释放试验BEAS2B细胞被培养在24孔组织培养板中，待细胞贴壁生长到形成单层后，移净原培养液并立即加入1mL含1×109/L正常或经多聚甲醛固定嗜酸性粒细胞的（事先加入100mL/L小牛血清）RPMI1640细胞培养液，嗜