急性移植肾排斥反应类固醇冲击治疗后淋巴细胞凋亡的作用

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1、急性移植肾排斥反应类固醇冲击治疗后淋巴细胞凋亡的作用作者：张波王禾张绍增武国军李欣杨晓剑于磊张更【关键词】肾移植　　Studyonapoptosisoftubularepithelialcellsandlymphocyteinacuterejectionofrenalallograftaftersteroidpulsetherapy　　【Abstract】AIM:Toexplorethechangesofapoptosisoftubularepithelialcellsandlymphocyteinacuterejectionofrenalallograf

2、taftersteroidpulsetherapy.METHODS:Renalbiopsyspecimensof64transplantrecipientsinedforapoptosis.Biopsiesedaftersteroidpulsetherapyandphocyteinfiltration.ApoptosiscellsofgraftsonitoredbyterminaldeoxynucleotidyltransferasemediateddUTPdigoxigeninnickendlabeling(TUNEL)analysis.RESULTS:

3、TheTUNELshophocytesphocyteapoptosis(P＝0.000).AccordingtotheBanffclassification,16casesphocyteapoptosisphocyteapoptosisisaphenomenonpredominantlyrestrictedtorejectionprocesses,ayberelatedtotheprognosisofacuterejection.　　【Keyo.急性排斥反应发生前血Cr为(118±17)μmol・L-1，发生中为(411±192)μmol&#

4、12539;L-1.发生急性排斥后连续3d用甲基强地松龙（第1日500mg，第2，3日分别为250mg）冲击治疗.在冲击治疗后第3日于B超或CT介导下用Menghini或Trucut穿刺针进行移植肾穿刺活检.对照组选取有淋巴细胞浸润的非排斥反应的移植肾活检标本40(男26，女14)例，平均年龄35岁.　　1.2试剂原位细胞凋亡检测试剂盒（insitucellapoptosisdetectionkitI，POD），购自武汉博士德公司，地高辛标记的三磷酸脱氧尿苷（DIGDUTP），德国BochringerMannhEim公司；末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT），

5、美国Promega公司；蛋白酶K、生物素标记的抗地高辛抗体（AntiDIGBiotin），美国Sigma公司.　　1.3方法　　1.3.1急性排斥的临床诊断标准①患者有发热、头昏、倦怠、血压升高、食欲减退、腹胀、并排除明显肺部感染、上呼吸道感染、尿路感染等并发症.②移植肾肿大和疼痛.有局部压痛、质地变硬、体积增大，并排除腹水压迫致移植肾疼痛或输尿管梗阻.③移植肾功能减退.表现为尿量减少，水、钠潴留，体质量迅速增加，血压升高，血Cr迅速上升,超过原来值的25%，并排除CsA肾毒性.　　1.3.2标本制备活检标本用升汞甲醛液固定10min后，然后放入Db液中固

6、定.常规石蜡包埋，切片.各例切片做常规苏木素伊红（HE）和PAS染色，显微镜观察，进行病理诊断.　　1.3.3实验步骤和判断标准移植肾活检标本石蜡切片常规脱蜡至水体积分数为3mL・L-1新鲜H2O2处理、蒸馏水洗涤；加Tris缓冲液（TBS）1∶100新鲜稀释蛋白酶K，37℃，10min，蒸馏水洗；加含TdT和DIGdUTP的标记缓冲液20μL，37℃，2h，TBS洗涤；加封闭液50μL，室温30min，甩干；加封闭液1∶100稀释的抗地高辛抗体55μL，37℃，30min，TBS洗涤；加TBS1∶100稀释的链霉亲合素生物素过氧化酶复合物（

7、SABC），37℃，30min，TBS洗涤；DAB显色20min，蒸馏水洗，苏木素复染，TBS洗；脱水，透明，封片.显微镜观察，细胞核中有棕黄色颗粒者为凋亡细胞.计算移植肾中10个肾小球1000个细胞中发生凋亡的浸润淋巴细胞或肾小管上皮细胞为5～10时用“+”表示，10～20个时为“”，>20个时为“”.　　统计学处理：应用SPLM软件进行数据分析,统计方法为Willcoxon秩和检验和χ2检验，P<0.05为差异有显著意义.　　2结果　　2.1急性排斥反应组与对照组凋亡细胞分布情况在急性排斥反应组中44例病例观察到淋巴细胞，34例患者观察到肾

8、小管上皮细胞凋亡，20例未检测到细胞凋亡，而对照组淋巴细胞发生凋亡