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1、补肾阴对胚胎干细胞活动的影响论文.freelbryostemcell.MethodsEmbryonicstemcelllineCRL-1825odelcellinpresentstudy,andtonifyingkidney-yinherbserumcelldifferentiation,cellcycle,apotosisandexpressofkeygenescelldifferentiationandapotosis,promotestemcellproliferationandprogressionofcellcycle.
2、Inaddition,tonifyingkidney-yincanup-regulateSO购自Sigma公司；α-MEM培养基购自Hyclone公司；DeadEndTMFluorometricTUNELSystem购自Promega公司；CCK8(CellCountingKit-8)试剂购自Dojindo公司。其余为国产试剂。1.2仪器培养箱：NUAIKE；流式细胞仪：BDFACSCalibur；倒置显微镜、免疫荧光显微镜：Olympus；酶标仪：Bio-Rad；PCR仪：MJResearchInc；凝胶成像系统：复日科技。2实
3、验方法2.1左归丸处方组成及药物制备熟地黄24g,山药12g,枸杞子12g,山茱萸12g,川牛膝9g,菟丝子12g,鹿角胶12g,龟板胶12g(按《景岳全书·新方八阵·补阵》中的配伍比例确定剂量)。以补肾中药气味并重的要求,上述药物除鹿角胶、龟板胶外,余药加8倍量水,煎煮2次,第1次2h,第2次1h,过滤,合并滤液。鹿角胶、龟板胶用适量水加热溶化,加入滤液,混匀,滤液浓缩至相对密度1.20(80℃),4℃保存备用。由龙华医院中药制剂室提供。2.2含药血清的制备选健康SO或1nmol/LATRA作用14h,各组细胞进行光镜拍照。根据
4、分化实验及预实验结果确定实验采用10%补肾阴中药复方大鼠含药血清中剂量组。2.4细胞增殖检测细胞增殖采用CCK8方法进行。常规消化细胞,以2×103的密度接种细胞于96孔板,每组设3个复孔；接种后第2天加入10%含药血清以及等体积空白对照血清,并自接种后第2天开始每天取9孔加入CCK8试剂10μL,37℃反应2h后,450nm波长测上清光密度。2.5细胞凋亡观测常规消化细胞,以1×105/盘的密度接种细胞于3.5cm培养皿,第2天加入10%含药血清以及等体积空白对照血清,作用3d后加入400μmol(终浓度)H2O2,作用14h后
5、取细胞检测凋亡。细胞凋亡采用TUNEL(TdT-meidateddUTPNick-EndLabling)法检测,操作按Promega公司说明书进行。2.6细胞周期的观测常规消化传代细胞,加入10%含药血清以及等体积空白对照血清作用,3d后细胞消化离心,调整浓度1×106/mL以上,70%酒精(终浓度)固定,PI(碘化吡啶)染色用于流式细胞仪检测细胞周期变化及增殖特性。2.7基因表达采用RT-PCR法检测基因表达,总RNA在逆转录酶的作用下逆转录成cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增,反应条件为：94℃变性30s,55℃退火3
6、0s,72℃延伸30s,PCR产物在1%的agarose胶中电泳。反应中所用引物为,Oct3/4：5’-ATTCAGCCAAACGACCAT-3’,5’-CCCTGAGAAAGGAGACCC-3’；P16INK4a：5’-CCCTTGCCTGGAAAGATA-3’,5’-AACTATTCGGTGCGTTGG-3’；SO作用下分化,细胞呈现出菱形或梭形,丧失干细胞特有的形态以及克隆生长特性；在补肾阴中药的联合作用下,细胞部分分化,有部分细胞尚维持干细胞的形态,并有部分细胞仍呈克隆生长,提示补肾阴可以阻滞干细胞的分化。3.2补肾阴对胚
7、胎干细胞增殖的影响(见表1、图2)表1补肾阴对胚胎干细胞周期的影响(略)注：与空白血清组以及空白组比较,*P0.05。3.3补肾阴对胚胎干细胞凋亡的影响本研究采用H2O2诱导细胞凋亡,观察补肾阴对细胞凋亡的影响。结果显示,补肾阴可抑制H2O2诱导的细胞凋亡,与对照组比较差异显著。3.4补肾阴对胚胎干细胞基因表达的影响在CRL-1825细胞培养基中加入10%含药血清以及等体积空白对照血清,提取细胞总RNA,RT-PCR检测补肾阴对干细胞基因表达的影响。结果显示,补肾阴可以促进干细胞,SommerL.,DiMascioLN,etal.
8、IntegrationofNotchand,EckardtS,ScholerHR,etal.Oct4distributionandlevelinmouseclones：consequencesforpluripotencyJ.GenesDev,20
