氨茶碱对大鼠气道平滑肌细胞分泌基质金属蛋白酶的影响

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1、氨茶碱对大鼠气道平滑肌细胞分泌基质金属蛋白酶的影响作者：张丙芳，张彩莲，范风云，苏明权，刘颖格，戚好文【关键词】,氨茶碱　　【Abstract】AIM：TostudytheeffectsofaminophyllineonthesecretionofmatrixmetalloprotEinases(MMPs)byratairoothmusclecells(ASMC)invitroandtoexploreitsrelationoothmusclecellsL/Lfetalcalfserumandcellsof4~6hgenerat

2、ionployedinexperimentandinophylline(0,50,100,200mL/L)for12~72h.Cellcountinophyllineatdifferentconcentrationsontheproliferationofthecultivatedcells.TheactivityandexpressionofMMP2andMMP9inedbyculturedinvitro(P<0.05).②MP2andMP3determinedbyCfromsecretingMMP2andMMP9,t

3、huspreventingtheproliferationofASMCandreconstructionofairpassage.　　【Keyinophylline;airyocytes,smoothmuscle;matrixmetalloproteases　　【摘要】目的：探讨氨茶碱对体外培养的大鼠气道平滑肌细胞（ASMC）分泌基质金属蛋白酶（MMPs）的影响及其与ASMC增殖抑制的关系.方法：分离大鼠气道平滑肌细胞，在含有100mL/L胎牛血清的DMEM中培养，第4～6代细胞用于实验，细胞用不同浓度氨茶碱（0，50，100

4、，200mg/L）诱导培养12～72h；采用细胞计数法观察并比较不同浓度氨茶碱对培养细胞的增殖抑制作用；MP2，MMP9的活性及表达.结果：①100和200mg/L浓度氨茶碱对体外培养大鼠ASMC增生较对照组有明显的抑制作用（P<005）；②当氨茶碱浓度＞50mg/L时，MP2和MMP9表达显著降低（P<005），且呈剂量依赖效应；③明胶酶谱也显示，浓度＞50mg/L的氨茶碱作用48h后，明胶酶活性较对照组显著降低，也呈剂量依赖效应.结论：氨茶碱通过剂量依赖效应抑制大鼠ASMC分泌MMP2和MMP9，从而阻止气道平

5、滑肌细胞增生和气道重塑.　　【关键词】氨茶碱；气道；肌细胞，平滑肌；金属蛋白酶类　　0引言　　气道平滑肌增生是气道重塑的重要组织学改变，它可直接使气道壁增厚、加重气道狭窄、产生气道高反应性，而且可以通过分泌多种细胞因子、炎性介质，加重气道炎症［1］.因此，抑制气道平滑肌增生已经成为治疗哮喘的主要措施.我们先前的研究表明［2］，氨茶碱可以通过抑制原癌基因cfos的表达抑制气道平滑肌增生，但氨茶碱与气道平滑肌细胞（ASMC）分泌MMPs的关系尚不清楚，我们的实验目的在于探讨氨茶碱对体外培养的大鼠气道平滑肌细胞（ASMC）分泌MMP

6、s的影响及其与ASMC增殖抑制的关系，为氨茶碱治疗哮喘提供新的理论依据.　　1材料和方法　　11材料　　健康雄性SD大鼠由第四军医大学实验动物中心提供；氨茶碱购自Sigma公司；兔抗大鼠MMP2和MMP9，HRP标记山羊抗兔IgG、蛋白质分子质量Marker购自武汉博士德公司；硝酸纤维素膜购自华美生物公司；C25g/L的胰蛋白酶消化第4～6代大鼠ASMC，含100mL/LFBS的DMEM培养液配制成单细胞悬液.将单细胞悬液以2×107/L密度接种于25mL细胞培养瓶，37℃，50mL/LCO2孵箱内培养.24h后换含5mL/L

7、FCS的DMEM培养液孵化细胞24h，使细胞进入生长静止状态.然后分别加入条件培养液（含0，50，100，200mg/L氨茶碱的100mL/LFCS的DMEM），干预48h后，提取细胞上清，离心以除去细胞碎屑后分装，保存于-70℃冰箱备用.每瓶消化细胞进行细胞计数3次.　　122明胶酶谱法测定细胞培养上清明胶酶活性配制80g/L的分离胶和50g/L的积层胶，将凝胶固定于BioRad电泳装置上，吸取备用的条件培养上清各10μL，分别与3×SDS凝胶加样缓冲液5μL充分混合后，按照预定顺序加样进行，将初始凝胶加电压8V/cm，当溴

8、酚蓝前沿进入分离胶后，再将电压提高至10V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部（约3～4h），然后关闭电源.洗脱、漂洗、孵育，将凝胶用25g/L考马斯亮蓝R250染色4h，脱色1～2h，直至凝胶出现清晰的负染区带.用蒸馏水漂洗后观察.将凝胶在蓝色滤光镜下照相，凝胶扫描后应