leptin对leptin受体在gh3细胞中表达的影响论文

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1、Leptin对Leptin受体在GH3细胞中表达的影响论文刘亚莉，钟延清，朱运龙，迟素敏【关键词】瘦素；GH3细胞；leptin受体【Abstract】AIM:Toobservetheinfluenceofleptinontheexpressionlevelofleptinreceptors(OBR)intheculturedGH3cells.METHODS:RTPCRmethodRNAexpressedinGH3cells,includingOBR(monform),OBRa(shortform)andOBRb(longfor

2、m).Afterleptin(10-8mol/L)treatmentfor48h,OBRaandOBRbmRNAlevelsinGH3cellsightregulatefunctionofGH3cellsthroughleptinreceptorsinGH3cellsdirectly,includinggroa公司)；DMEM(美国Gibco公司)；新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)；反转录试剂盒,.freelega公司)；TaqDNA聚合酶和DNAMarker(大连宝生物工程有限公司)；琼脂糖(洛阳华美生物工程公司).所有引

3、物均由大连宝生物工程有限公司合成.1.2方法1.2.1细胞培养大鼠生长激素瘤GH3细胞在含120mL/L小牛血清DMEM培养液中常规培养、传代，加入2.5g/L胰蛋白酶和0.2g/LEDTA(1∶1)消化细胞，1000r/min离心5min，弃上清，加入含120mL/L小牛血清的DMEM培养液，轻吹起细胞，调整细胞密度，以5×108/L的密度接种于96孔板，每孔100mL，移入CO2孵箱，在37℃，50mL/LCO2及饱和湿度条件下培养，24h换液，之后每隔48h换液1次.1.2.2逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）1.2.2.1细胞总

4、RNA的提取GH3细胞以5×108/L的密度接种于直径6cm的培养皿中，移入CO2孵箱中培养，培养条件同上.培养5d后，收集细胞，用预冷灭菌的生理盐水洗涤沉淀，将1mLTrizol加到培养皿中，轻摇培养皿至液体浸润到各处，待细胞悬浮后，将液体移入1.5mL离心管中，冰上静置5min，加入200mL氯仿，震荡混匀，于室温下静置15min，4℃，12000g离心15min，小心吸取上层水样（约300～400mL），转入新的离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，冰上沉淀10min，4℃，12000g离心10min，RNA沉附于管底或管壁.750m

5、L/L乙醇洗涤1次，4℃，7500g离心10min，去除乙醇液体，将RNA沉淀风干，用20mL无RNA酶水55℃溶解15min，-20℃保存备用.所有获取的RNA用分光光度计读取A值，计算RNA的含量，并用A260nm/A280nm比值判断RNA的纯度.1.2.2.2cDNA的合成以提取的总RNA为模板，cDNA合成反应体系为20μL，包括提取的总RNA5μL，25mol/LMgCl24μL，10×PCR缓冲液2μL，dNTP(10mmol/L)2mL，RNA酶抑制剂0.5μL，AMV反转录酶1μL，OligodT1μL，其余用无RNA酶

6、水补充至20μL，混匀后42℃水浴60min，沸水浴5min灭活反转录酶.1.2.2.3PCR反应取合成的cDNA模板1μL，依次加入10×PCR缓冲液2.5μL，4×dNTP混合物1μL，TaqDNA聚合酶0.125μL，人OBR,OBRa和OBRb引物各0.5μL（OBR引物：sense：5′CTCCGCACTCACAGGCAACA3′,antisense：5′TGGATCGGGCTTACAACAA3′；OBRa引物：sense：5′CCTATCGAGAAATATCAGTTTA3′,antisense：5′T

7、CAAAGAGTGTCCGCTCTCT3′；OBRb引物：sense：5′AGAATTGTTCCTGGGCACAAG3′,antisense：5′ACACTCATCCTCACAGGTTCC3′），加无菌去离子水补至25μL，首次循环94℃4min，然后94℃变性1min，OBR63℃退火1min，OBRa55℃退火1min，OBRb65℃退火1min，72℃延伸1min，末次循环72℃延伸6min.以不加入模板为阴性对照组，18S为内对照（18S引物：sense：5′CGGCTACCACATCCAAGGAA3′，

8、antisense：5′GCTGGAATTACCGCGGCT3′）.取PCR产物10μL，在20g/L琼脂糖凝胶电泳以Φ×174DNA/HaeⅢMarker为标准分子量，经凝胶图像分析仪分