ras┐mapk信号转导系统在哮喘气道重塑中的作用论文

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1、Ras┐MAPK信号转导系统在哮喘气道重塑中的作用论文宋立强戚好文郎兵刘飞【关键词】,.freelin间数个时间点，采用Dot-blot分子杂交法检测气道rasmRNA水平.免疫组化ABC法研究气道Ras和MAPK蛋白的表达情况.结果与正常对照组相比，哮喘组豚鼠气道上皮水肿、脱落，平滑肌层及基底膜显著增厚.诱喘后rasmRNA的表达水平明显上调，30min达高峰并维持至120min.各级气道的上皮和平滑肌细胞Ras表达量显著增加，而MAPK只在气道平滑肌层呈现高表达现象.结论Ras-MAPK信号转导系统在

2、哮喘气道重塑早期发挥重要作用，阻断这一途径有望延缓重塑的病理过程.Keya;airodeling;signaltransductionAbstract:AIMToinvestigatetheroleofRas-MAPKsignaltransductionpathodelingofaira.METHODSTheasthmamodelsinguineapigs.freelRNAinair-inedbyDot-blotmolecularhybridizationatseveralpointsafterprovo

3、kation（0，30，60，120，240min）.Immunohis-tochemicaltechniquesalgroup，asthmaanimalairaanddropofepitheliumcells，thickeningofsmoothmusclelayerandbasemembrane.AndthelevelofrasmRNAincreasedobviously，reachingthepeak30minandmaintainingto120minaftertheprovocation.The

4、expressionofRasandsmoothmusclelayersofairoothmusclecells.CONCLU┐SIONRas-MAPKsignaltransductionpath-portantroleinairodelinginasthmaatearlyage，thusblockingthepathologicalprocessmaybeapotentialtreat-mentstrategy.0引言气道重塑（airodeling）是指哮喘患者气道中平滑肌和基底膜增厚的异质性改变.由此

5、导致气流不可逆阻塞和持续的气道高反应性，现认为是顽固性哮喘的重要病理基础［1］.我们的前期研究［2］结果表明，气道壁c-fos，c-myc，c-jun和c-sis等原癌基因表达增强是气道重塑的重要早期事件.那么，真核细胞中对生长和发育具有调节功能的Ras-MAPK信号转导系统，在重塑中是否介导基因的表达过程?目前尚不清楚.我们以豚鼠哮喘模型为对象，探讨Ras-MAPK途径激活情况与气道重塑的关系.1材料和方法1.1材料抗pan-Ras及MAPKmAb分别购自武汉博士德、Sigma公司.含rascDNA的质

6、粒由第四军医大学生物化学和分子生物学教研室提供，Trizol购自Gibco公司，质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司，各种限制性内切酶购自宝灵曼公司.1.2方法1.2.1动物模型及标本制备第四军医大学实验动物中心提供成年雄性豚鼠40只，体质量300～350g，随机平分为哮喘组和正常对照组.哮喘组用10gL-1卵蛋白（OVA）和10gL-1氢氧化铝混悬溶液0.5mL，ip，致敏，第8日重复注射1次;第15日始雾化吸入OVA激发动物哮喘发作，隔日1次，共10次.对照组以同样方法致敏，但吸入生理

7、盐水而非OVA.分别在末次激发试验后即刻、30，60，120及240min处死相应动物.①提取总RNA:动物放血后，迅速剥离气管及主支气管，Trizol法提取总RNA;②制备发作后30min动物气道组织切片:40gL-1多聚甲醛经右心室灌注并取气管和肺，200gL-1蔗糖浸泡后，于-20℃下制备20μm冰冻切片.1.2.2Dot-blot杂交法检测气道rasmRNA的表达将含rascDNA的质粒转染DH5α感受态细菌，扩增制备质粒，用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，琼脂糖凝胶电泳回收cDNA片段，并α-3

8、2P-dCTP随机引物法标记cDNA探针.将提取的总RNA移至尼龙膜上，预杂交后加入含探针的杂交液进行反应.放射自显影后图像分析仪行灰度扫描半定量.1.2.3免疫组织化学法检测气道Ras和MAPK的表达切片经KPBS漂洗后，分别加入小鼠抗鼠Ras或MAPKmAb（1∶100），4℃孵育48h.漂洗3次，加入生物素化羊抗小鼠IgG（Sigma，1∶400），4h后漂洗并与ABC复合物（1∶400）孵育2h.DAB与硫酸镍胺醋酸缓