rapd在绞股蓝种类鉴别应用上的条件摸索论文

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1、RAPD在绞股蓝种类鉴别应用上的条件摸索论文罗育，李雄英，吴耀生，蒋军富，赵瑞强，曾麒燕【摘要】目的为采用随机扩增多态性技术鉴别绞股蓝及其易混品乌蔹莓，进行RAPD条件摸索。方法运用改进CTAB法提取七叶绞股蓝、五叶绞股蓝、乌蔹莓以及烟草基因组DNA，摸索影响RAPD的条件。结果用改进CTAB法提取所得的DNA质量较好.freelmapentaphyllumfromthemixedplant,CayratiajaponicaprovedCTABmethodeDNAfromJiaoGuLan(Gynostemmapentaphyllum)SevenLeavesJiaoGuLa

2、n,CayratiajaponicaandTobacco,respectively.TheoptimumconditionsofRAPDprovedCTABmethod,theextractedDNApresentedbetterqualityandcouldbeusedtoprogressRAPD.TheoptimumconditionsforRAPDhavebeensuccessfullyexplored.ConclusionTheimprovedCTABmethodissuitabletoextractgenomeDNAfromthefourmedicinalplan

3、ts,respectively,andtheconditionsexploredmaPentaphyllumanddistinguishitfromthemixedplant,Cayratiajaponica.Keymapentaphyllum;GenomeDNA;RAPD;Identification绞股蓝Gynostemmapentaphyllum，(Thunb)Makino系葫芦科绞股蓝属多年生攀缘草质藤本植物。绞股蓝具有较广泛的生态适应性，自然分布于秦岭及长江以南的15个省区。绞股蓝全草入药，有清热解毒、镇咳祛痰、抗癌、降血脂、防衰老、抗疲劳等功能，临床上应用于老年

4、慢性支气管炎、哮喘、胃肠炎和传染性肝炎等疾病的治疗。从绞股蓝属植物中分离出的84种皂苷中有6种与人参皂苷的四环三萜达玛烷型结构完全相同，所以有“南方人参”的美誉。RAPD（randomamplifiedpolymorphicDNA）技术是1990年由akino和乌蔹莓Cayratiajaponica(Thunb)Gagn由广西药用植物园凌征柱教授提供；烟草（Tobacco）由中国科学院上海植物生理生态研究所提供。因绞股蓝掌状叶片常有五枚小叶，本文中称为五叶绞股蓝；另外，采集了另一种掌状叶片均为七枚小叶的绞股蓝，本文中称为七叶绞股蓝，其种类待鉴定。1.2仪器电泳仪（DYY-1

5、0C型，北京六一仪器厂）；SmartspecTMplus核酸蛋白测定仪（Bio-RADLab，Inc，USA.）；MyCyclerTMPCR仪(Bio-RADLab,Inc，USA.)；UVI-7600Z凝胶成像系统。1.3试剂CTAB，BSA（牛血清白蛋白），琼脂糖，10碱基引物均购自上海生工生物工程有限公司；Taq酶，dNTP，MgCl2均购自宝生物工程（大连）有限公司。2方法2.1基因组DNA的提取采用CTAB法，参照陈莉等［5］方法加以改进。具体操作：①新鲜叶片液氮中过夜，加液氮进行研磨至细粉末状后，迅速转入离心管中；加65℃预热1.5×CTAB提取缓冲液［1.5%

6、CTAB，75mmol/LTris-HC1(pH8.0)，15mmol/LEDTA(pH8.0)，1.05mol/LNaCl］混匀，65℃水浴20min；取出冷却至室温，6200r/min离心10min。②收集上清液，加等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1）混匀，6200r/min离心10min。再收集上清液，加1/10体积1×CTAB提取缓冲液（1%CTAB，0.7mol/LNaCl）及等体积氯仿∶异戊醇（24∶1）混匀，6200r/min离心10min；重复1次。③上清液加入等体积1×CTAB沉淀缓冲液［1.0%CTAB，50mmol/LTris-HC1(pH8.0)，10m

7、mol/LEDTA(pH8.0)］混匀，65℃水浴30min。冷却至室温，6200r/min离心10min。弃上清液，加0.5ml1mol/LNaCl，沉淀完全溶解后加2.5倍体积预冷无水乙醇，混匀。-20℃下静置15min，5200r/min离心5min。弃上清液，加70%乙醇漂洗沉淀2次，沉淀自然挥干。④最后加300μl灭菌dddH2O或TE（含10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，pH8.3），溶解后作为母液DNA于-20℃下储存。各取基因组DNA母液5μl在1.5%琼脂糖凝胶上，100v