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1、心肌细胞肿胀激活氯离子通道的单通道特性作者：王军，徐洪涛，吴燕红，孙喜庆【关键词】心肌/细胞学Singlechannelpropertiesofsyocytes 【Abstract】AIM:Tocharacterizethesinglechannelpropertiesofsousecardiacmyocytes.METHODS:Thecardiacmyocytesmouseheartsandputinahypotonicsolution.Cellattachedandinsideoutpatchclampmetho
2、dsployedtorecorllthesostpatches.Hypotonicsuperfusioninducedcellsmetricalcondition,thecurrentinducedbyhypotonicityshoVininsideoutpatchrecordings.Thereversalpotential(-34.5±2.8)mVofthecurrentpotentialforCl-(ECl=-38.6mV).gSO41.2,Hepes10,葡萄糖11(用NaOH调pH至7.4). 1.2.2电
3、生理学实验取分离好的单个心肌细胞置于灌流槽中，灌流无钙台氏液.待细胞稳定贴壁后，灌流等渗细胞外液，形成巨阻封接，室温下采用膜片钳单通道细胞贴附式和内面向外式方法［1］记录肿胀激活单通道氯电流.电极采用硼硅酸玻璃管经电极拉制器(P2000:SutterInstruments,Novato,CA)多步拉制而成.冲灌电极液后电阻为5~6MΩ.电流经EPC9放大器(HEKAElectroniks,Lambrecht,德国)放大后，电流信号采样频率为10kHz，经滤波后，记录到Pulse和Pulsefit软件系统中(HEKAEl
4、ectroniks,Lambrecht,德国).数据分析应用PulseMate和Origin6.1(OriginLabInc.,Northampton,MA)软件. 电生理学实验所用液体：电极内液（mmol/L）:NMDGCl85,NaCl10,4AP2,BaCl22.5,NaH2PO40.33,MgCl24,Hepes10,glucose5.5,TEACl5,TTX8μmol/L,nifidipine5μmol/L,（用NMDGOH调节pH到7.4）,加入甘露醇调节溶液的渗透压为305Osmmol/kg.低渗灌流液
5、（mmol/L）:NMDGCl113,MgATP5,NaGTP0.3,EGTA5,Hepes5（NMDGOH调节pH值到7.4）,渗透压为230Osmmol/kg.在研究氯离子通道选择性的实验中，灌流液中等量的Cl-由天冬氨酸代替.为验证肿胀激活单通道氯电流对氯通道阻断剂DIDS的敏感性，用含有500mol/LDIDS的低渗灌流液灌流细胞，观察其对单通道开放概率的抑制作用.等渗灌流液是在低渗溶液中加入甘露醇调节渗透压到305Osmmol/kg.实验过程中灌流液中持续加入8μmol/LTTX，5μmol/Lnifidip
6、ine以阻断电压依赖性Na+通道和LtypeCa2+通道.所有溶液的渗透压应用冰点渗透压测量仪(OM802,Vogel,德国)测量.阻断剂DIDS用二甲基亚砜（DMSO）配置50mmol/L的储存液保存，使用时稀释到500μmol/L灌流细胞. 统计学处理：采用SPSS11.0统计学软件包完成，所有数据以x±s表示.用阻断剂前后的比较采用配对t检验，P<0.05即认为有统计学差异.2结果 2.1小鼠心肌细胞肿胀激活单通道氯电流的电压依赖性在等渗状态下（305Osmmol/kg），多数小鼠心肌细胞膜片无通道活动
7、.低渗溶液(230Osmmol/kg)灌流细胞，15～30min后，细胞容积增大，同时，有些在等渗条件下无通道活动的膜片出现单通道电流的激活，通道激活的时间一般是在低渗溶液灌流后的(13±4)min.一旦单通道电流出现，就将该膜片游离形成内面向外式记录方式.Fig1A所示的即为在等渗时无电流活动，用低渗溶液灌流后出现通道活动的一个膜片记录结果.可见，在细胞内外氯离子浓度对称（113mmol/L）时，在电压-100mV~+100mV范围内，均有通道开放，且能稳定20min以上，在+100mV和-100mV钳制电压时，电流
8、的幅度分别为(3.81±0.25)pA和（-1.32±0.16）pA,(n=11)，表现出明显的外向整流特征.Fig1B为单通道电流的电流/电压（I/V）曲线.当低渗灌流液（细胞内侧）中氯离子的浓度由113mmol/L改为25mmol/L时，电流的反转电位向更负的方向偏移，由0mV偏移到了（-34.5±2.8)mV(n=11).
