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1、P16基因产物在人类肝细胞癌中的表达及临床意义单铁英董永杰刘晓霞摘要目的：探讨P16蛋白在肝细胞癌中的表达，并推测P16基因在肝细胞癌发生、发展过程中的作用及临床意义。方法：采用免疫组化SP法测定26例肝细胞癌及癌旁肝细胞中P16蛋白表达进行对比研究。结果：26例肝细胞癌P16蛋白表达量明显低于癌旁肝组织。P16蛋白表达量随病理分级增高而降低。部分肝细胞癌组织存在P16蛋白的表达缺失现象。结论：P16蛋白表达障碍可能与肝细胞癌的发生和组织分化有关。可考虑将P16蛋白作为本病预后分析的参考指标值。 关键词肝细胞性肝癌；P16基因；免
2、疫组织化学 肝癌是我国高发的消化道肿瘤之一。它的发生是一个涉及多种癌相关基因协同作用的结果。P16基因是一个抑癌基因,它的作用已受到越来越多的重视。P16抑癌基因由美国Kamb［１］等首先报道,其产物(编码蛋白)即P16基因蛋白，它参与细胞周期的调节，它的表达异常会导致细胞周期调节紊乱，使细胞过度分裂诱发肿瘤发生［２～5］。本研究用免疫组化链霉素生物素-过氧化酶连接法(SP法)测定肝癌细胞(HepatocellularCarcinoma,HCC)、癌旁肝细胞中P16基因蛋白的表达状况,并对照分析P16蛋白表达与组织学分级关系,以分
3、析P16蛋白测定在HCC临床中的地位,推测P16基因在HCC发生发展过程中的作用。 1材料与方法 1.1材料 本实验所选用的26例肝癌组织及相应的癌周组织标本,取自邯郸市中心医院和河北工程学院附属医院普外科2003年2月～2005年11月期间的手术患者,其中男19例，女7例，年龄37岁～70岁，26例病人乙肝表面抗原均呈阳性。所有患者术前均未进行任何化疗或放疗等,EdmondsonHCC组织学分级标准，Ⅰ级2例，Ⅱ级15例，Ⅲ级6例，Ⅳ级3例。这些组织在制成切片前均经10%的福尔马林溶液固定后石蜡包埋。 1.2试剂 兔抗人
4、P16单克隆抗体购自北京中山生物技术有限公司，免疫组化SP试剂盒购自ZYMED公司。 1.3方法 石蜡切片4μm，常规脱蜡入水，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶20min，微波炉热修复抗原10min，10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10min，倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的P16单抗，4℃过夜，加适当比例稀释的生物素标记的二抗室温30min，滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素室温30min,以上步骤均以PBS缓冲液漂洗,3min/次，DAB显色，苏木素复染胞核，常规脱水透明封片，实验中以PBS代替一抗作阴性
5、对照。光镜下（×400）随机选取10个视野，每个视野计数100个细胞，共计数1000个细胞，无阳性细胞者为阴性（-），<30%细胞着色为阳性（+），>30%细胞着色为强阳性（）。 1.4统计学分析采用SPSS10.0软件进行统计学处理，各样本差异的比较采用χ２检验，检验水准=0.05。 2结果 免疫组化研究结果显示，肝癌组织中P16蛋白的染色大多数为胞浆着色，未见胞核着色。肿瘤细胞胞浆着色大多不均匀，而正常癌旁肝组织着色大多成均匀的棕黄色。结缔组织不着色。 26例肝癌中，P16蛋白阳性9例，其中6例（+）、3例（
6、），阳性率34.6%。癌旁组织阳性２５例，阳性率9６.４％。癌旁组织阳性率明显高于肝癌组织（P<0.01）。 P16表达水平与肿瘤分化程度的关系（P<0.05，见表1）。表1肝癌分级与P16表达水平之间的关系（略） P16蛋白表达水平与肿瘤大小、AFP值、病人年龄、性别无显著关系(P>0.05，见表2）。表2肝癌P16表达与临床指标的关系（略）(责任编辑：admin) 3讨论 肿瘤组织的过度生长有赖于其细胞的过度分裂,细胞分裂周期是由一组称为细胞周期素(Cyclin)的蛋白和一组依赖于Cyclin的蛋白激酶
7、CDK(cyclindependentkinase)所调控的。其中CyclinD/CDK4所形成的复合物能够磷酸化抑癌基因Rb(成视网膜细胞瘤retinoblastoma)的产物PRb(成视网膜细胞瘤蛋白retinoblastomaprotein);非磷酸化的PRb与转录因子E2F结合,可抑制E2F的启动基因转录及细胞增殖［６］。P16基因定位于染色体9P21，它编码的蛋白能特异地抑制细胞周期素依赖性激酶4（CDK4）的活性,其蛋白的N末端因含有Cyclinbox同源序列,所以P16蛋白可与CyclinD1竟争与CDK4结合,使CD
8、K4失活,阻止CDK4/CyclinD复合物的形成,避免PRb磷酸化,阻止细胞由G1期进入S期，对细胞生长周期起负调控作用［７］。P16基因的抑制作用减弱,可导致细胞的过度分裂，引起肿瘤发生。 免疫组织化学方法对P16蛋白检测比较敏
