p16 基因产物在人类肝细胞癌中的表达及临床意义

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1、P16基因产物在人类肝细胞癌中的表达及临床意义作者：单铁英董永杰刘晓霞摘要目的：探讨P16蛋白在肝细胞癌中的表达，并推测P16基因在肝细胞癌发生、发展过程中的作用及临床意义。方法：采用免疫组化SP法测定26例肝细胞癌及癌旁肝细胞中P16蛋白表达进行对比研究。结果：26例肝细胞癌P16蛋白表达量明显低于癌旁肝组织。P16蛋白表达量随病理分级增高而降低。部分肝细胞癌组织存在P16蛋白的表达缺失现象。结论：P16蛋白表达障碍可能与肝细胞癌的发生和组织分化有关。可考虑将P16蛋白作为本病预后分析的参考指标值。　　关键词肝细胞性肝癌；P16基因；免疫组织化学　

2、　肝癌是我国高发的消化道肿瘤之一。它的发生是一个涉及多种癌相关基因协同作用的结果。P16基因是一个抑癌基因,它的作用已受到越来越多的重视。P16抑癌基因由美国Kamb［１］等首先报道,其产物(编码蛋白)即P16基因蛋白，它参与细胞周期的调节，它的表达异常会导致细胞周期调节紊乱，使细胞过度分裂诱发肿瘤发生［２～5］。本研究用免疫组化链霉素生物素-过氧化酶连接法(SP法)测定肝癌细胞(HepatocellularCarcinoma,HCC)、癌旁肝细胞中P16基因蛋白的表达状况,并对照分析P16蛋白表达与组织学分级关系,7以分析P16蛋白测定在HCC临床

3、中的地位,推测P16基因在HCC发生发展过程中的作用。　　1材料与方法　　1.1材料　　本实验所选用的26例肝癌组织及相应的癌周组织标本,取自邯郸市中心医院和河北工程学院附属医院普外科2003年2月～2005年11月期间的手术患者,其中男19例，女7例，年龄37岁～70岁，26例病人乙肝表面抗原均呈阳性。所有患者术前均未进行任何化疗或放疗等,EdmondsonHCC组织学分级标准，Ⅰ级2例，Ⅱ级15例，Ⅲ级6例，Ⅳ级3例。这些组织在制成切片前均经10%的福尔马林溶液固定后石蜡包埋。　　1.2试剂　　兔抗人P16单克隆抗体购自北京中山生物技术有限公司，

4、免疫组化SP试剂盒购自ZYMED公司。　　1.3方法　　石蜡切片4μ7m，常规脱蜡入水，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶20min，微波炉热修复抗原10min，10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10min，倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的P16单抗，4℃过夜，加适当比例稀释的生物素标记的二抗室温30min，滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素室温30min,以上步骤均以PBS缓冲液漂洗,3min/次，DAB显色，苏木素复染胞核，常规脱水透明封片，实验中以PBS代替一抗作阴性对照。光镜下（×400）随机选取10个视野，每个视野计数100

5、个细胞，共计数1000个细胞，无阳性细胞者为阴性（-），<30%细胞着色为阳性（+），>30%细胞着色为强阳性（）。　　1.4统计学分析采用SPSS10.0软件进行统计学处理，各样本差异的比较采用χ２检验，检验水准=0.05。　　2结果　　免疫组化研究结果显示，肝癌组织中P16蛋白的染色大多数为胞浆着色，未见胞核着色。肿瘤细胞胞浆着色大多不均匀，而正常癌旁肝组织着色大多成均匀的棕黄色。结缔组织不着色。7　　26例肝癌中，P16蛋白阳性9例，其中6例（+）、3例（），阳性率34.6%。癌旁组织阳性２５例，阳性率9６.４％。癌旁组织阳性率明显

6、高于肝癌组织（P<0.01）。　　P16表达水平与肿瘤分化程度的关系（P<0.05，见表1）。表1肝癌分级与P16表达水平之间的关系（略）　　P16蛋白表达水平与肿瘤大小、AFP值、病人年龄、性别无显著关系(P>0.05，见表2）。表2肝癌P16表达与临床指标的关系（略）　　3讨论　　肿瘤组织的过度生长有赖于其细胞的过度分裂,细胞分裂周期是由一组称为细胞周期素(Cyclin)的蛋白和一组依赖于Cyclin的蛋白激酶CDK(cyclindependentkinase)所调控的。其中CyclinD/CDK4所形成的复合物能够磷酸化抑癌基

7、因Rb(成视网膜细胞瘤retinoblastoma)的产物PRb(成视网膜细胞瘤蛋白retinoblastomaprotein);非磷酸化的PRb7与转录因子E2F结合,可抑制E2F的启动基因转录及细胞增殖［６］。P16基因定位于染色体9P21，它编码的蛋白能特异地抑制细胞周期素依赖性激酶4（CDK4）的活性,其蛋白的N末端因含有Cyclinbox同源序列,所以P16蛋白可与CyclinD1竟争与CDK4结合,使CDK4失活,阻止CDK4/CyclinD复合物的形成,避免PRb磷酸化,阻止细胞由G1期进入S期，对细胞生长周期起负调控作用［７］。P16

8、基因的抑制作用减弱,可导致细胞的过度分裂，引起肿瘤发生。　　免疫组织化学方法对P16蛋白检测比较敏感［８］，