清肝活血方及其拆方对酒精性肝损伤大鼠肿瘤坏死因子α表达的影响

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1、清肝活血方及其拆方对酒精性肝损伤大鼠肿瘤坏死因子α表达的影响作者：吴涛,柳涛,郑培永,邢练军,季光【摘要】目的：观察清肝活血方及其拆方对酒精性肝损伤（alcoholicliverinjury,ALI）大鼠肝脏肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactorα,TNFα）mRNA表达和血浆TNFα含量的影响。方法：除空白组和四氯化碳（carbontetrachloride,CCl4)组外，80只雄性arker(上海申能博彩生物科技有限公司)；焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonat

2、e,DEPC）和琼脂糖(Sigma公司)；氯仿和异丙醇(上海试剂一厂)。DY891型电动玻璃匀浆机，宁波新芝科器研究所产品；低温离心机，Eppendorf公司产品；iCyclerPCR仪，BIORAD公司产品；RNA/DNA测量仪，Pharmacia公司产品；凝胶成像系统，上海四星生物技术有限公司产品；电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司产品；UV2102C型紫外可见分光光度计，UNICO公司产品；MK3型酶标仪，ThermoLabsystems公司产品。1.2实验方法1.2.1造模和给药造模组

3、以60度二锅头酒10ml︰玉米油2ml︰吡唑25mg比例混合物灌胃，灌胃量为10ml/(kg·d)，分早、晚两次灌服。第2周开始腹腔注射CCl4和橄榄油溶液（CCl4︰橄榄油=1︰3），2次/周，每次注射0.3ml/kg体质量，造模共6周［4］。空白组（n＝10）和CCl4组（n＝10）以等量生理盐水灌胃，CCl4组仅以等量CCl4橄榄油溶液腹腔注射，空白组以等量生理盐水腹腔注射。在造模的第1、2、3、4和5周各取2只模型大鼠做病理分析。造模4周后，72只模型大鼠随机分为清肝活血方组、清肝方组、活血方组

4、各15只，余为模型组。各中药组分别予清肝活血方、清肝方、活血方灌胃，剂量为10ml/(kg·d)，共2周。模型组、空白组和CCl4组灌服等量生理盐水。造模6周后以2％戊巴比妥钠（2ml/kg）腹腔注射麻醉处死大鼠，腹主动脉采血，分别放于抗凝管和无抗凝剂试管中，4℃静置2h，3000r/min15min，离心分离血清和血浆，－80℃备用。摘取肝脏称质量后，于肝右叶切取1.0cm×1.0cm×0.2cm大小肝组织2块，4%中性甲醛溶液固定。剩余肝组织液氮中速冻后－80℃冰箱保存。1.2.2观察项目和方法1.

5、2.2.1肝脏组织病理改变石蜡切片，HE染色，光学显微镜下观察肝脂肪变性和炎症程度。肝细胞脂肪变性程度判断标准参照Diehl等［5］法，炎症活动度计分标准参考Knodell等［6］提出的慢性肝炎组织学活动指数(hepatitishistologicalactivityindex,HAI)，并结合王泰龄等［7］提出的慢性肝炎炎症活动度计分方案。取两者积分总和的结果进行统计分析。1.2.2.2血清丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶活性检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase

6、,ALT)和天冬氨酸氨基转移酶（aspartateaminotransferase,AST)活性检测均采用7170S全自动分析仪速率法进行检测。1.2.2.3RTPCR法检测肝组织TNFαmRNA表达取肝组织100mg按照TRIzolReagent液说明书提取总RNA，然后用紫外分光光度计定量，检测260nm和280nm光密度值，确认两者比值在1.8～2.0之间，按照试剂盒说明书进行cDNA的逆转录。总RNA经RT反应后进行PCR扩增，采用AMV20μl体系，第一链cDNA1μl，10×PCRBuf

7、fer2μl，dNTP1μl，目的基因正负链各0.22μl，βactin正负链各0.1μl，Taq酶0.2μl，DEPCH2O14.2μl。反应条件为：95℃预变性5min，95℃30s、60℃40s、72℃1min，26次循环，72℃延伸10min。用密度扫描仪对特异性条带进行密度扫描，测得其灰度值，其与相应的βactin灰度值之比表示TNFαmRNA的相对表达量。TNFα上游序列5'ATCGGTCCCAACAAGGAGGAGAAGT3'，扩增片段长度166bp；TNFα下游序列5'T

8、CCTTAGGGCAAGGGCTCTTGATGG3'，扩增片段长度545bp。βactin上游序列5'TGTGATGGTGGGTATGGGTCAGAAG3'，扩增片段长度207bp；βactin下游序列5'TCACGGTTGGCCTTAGGGTTCAGAG3'，扩增片段长度431bp。以上引物由上海生工生物有限公司合成。1.2.2.4ELISA法检测血浆TNFα含量按照上海钰森生物技术有限公司TNFαELISA检测试剂盒说